قسم علوم الحياة يناقش رسالة ماجستير تبحث دور بروتينات الالتهاب في طريقة تطور مرض التحسس القمح

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة ( دور Inflammasome في امراضية مرض التحسس للقمح ) للطالبة ( هبــة محسن علي ) التي انجتها تحت اشراف التدريسية في القسم ( أ.د. أنوار أدريس سليمان ) .

وتهدف الدراسة الى التقصي عن دوربروتينات الالتهاب NLRP3 في عينة الأطفال العراقيين المصابين بمرض الاضطرابات الهضمية من خلال بعض العوامل المناعية والوراثية، لذلك تم التخطيط  للأهداف التالية:

1. تقييم مستويات انترليوكين-1بيتا (IL-1β) في مصول الأطفال المصابين بالاضطرابات الهضمية ومقارنتها مع المجموعة الضابطة.

2. تحديد مستوى التعبير الجيني لبروتينات الألتهاب NLRP3 Inflammasome باستخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي RT-qPCR)) .           

3. 3. أيجاد العلاقة بين العمر والجنس والطول والوزن والعوامل المناعية ومستويات التعبير الجيني لبروتينات الألتهاب  NLRP3 Inflammasome .

وبينت الطالبت في رسالتها ان مرض الاضطرابات الهضمية (الداء البطني، الداء الزلاقي او ما يعرف بحساسية القمح) هو اضطراب المناعة الذاتية ويتميز بالالتهاب المزمن الذي يصيب بشكل أساسي الأمعاء الدقيقة، وينتج عن تناول الأطعمة التي تحتوي على الغلوتين. وقد صممت الدراسة الحالية للتعرف على بعض الجوانب المناعية والوراثية للمرض لدى لمرضى العراقيين المصابين بحساسية القمح. اذ شملت الدراسة 30 عينة من الاطفال المشخصين بالمرض (ذكور واناث) وكانت اعمارهم تتراوح ما بين 3-15 سنة من المرضى الوافدين الى العيادة الاستشارية في مستشفى الطفل المركزي، ومستشفى التمريض الخاص والمركز التخصصي لأمراض الغدد الصماء والسكري/ مستشفى الكندي في بغداد خلال المدة من أب 2018 إلى أذار 2019. وقد تم التأكد من اصابتهم بالمرض عن طريق الفحوص المصلية والتنظير المعوي. فضلاً عن ذلك، فقد شملت الدراسة 20 طفلاً سليما وبأعمار مقاربة لاعمار المرضى، ويمثلون المجموعة الضابطة وقد تم اختيارهم بشكل عشوائي من الأطفال الذين لديهم تاريخ سلبي لامراض المناعة الذاتية.

تمت دراسة العديد من الخصائص العامة والسريرية للمرضى اضافة الى إجراء الكشف المصلي باستخدام طريقة ELISA لتحديد مستويات كلا من مضادات انزيم النسيج الجلوتامينيز anti-tissue glutaminase IgA (anti-tTG) ومضادات الجليادين anti-gliadin IgA (AGA) ومستويات الانترلوكين-1بيتا IL-1β في مصول المرضى والاصحاء. وشملت الدراسة الجزيئية تحديد مستوى التعبير الجيني  لبروتينات الالتهاب NLRP3 Inflammasome في عينات الدم المحيطي للمجموعات المدروسة من خلال استخدام تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). واستنادا إلى الخصائص العامة، والنسيجية، والفحص المصلي والجزيئي، توصلت الدراسة إلى الاستنتاجات التالية:

1. أزداد حدوث المرض في الاطفال بعمر (5-9) والعمر (10-14) بنسبة 40% و50% على التوالي. وبلغ معدل كتلة الجسم (BMI) في المرضى (2.4±2.51كغم/م²) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة (18.2±3.6 كغم/م²( مع وجود فروق معنوية عالية (الاحتمالية ≤ 0.05). وفيما يتعلق بالوزن، فقد اظهر متوسط وزن المرضى انخفاظا معنويا واضحا مقارنة من مجموعة السيطرة (22.9±7.2 و31.1±11.6 كغم على التوالي) (الاحتمالية≤ 0.05). وقد كان تكرار حصول المرض حوالي (73.3%) في المرضى ذوي الاباء الاقارب يتبعه (26.7%) في المرضى من ابوين غير اقرباء وبعدم وجود فروق معنوية (الاحتمالية> 0.05). وكان تكرار حدوث المرض في الاطفال الذين لديهم تاريخ عائلي للمرض اعلى بكثير (66.7%) من الاطفال الذين كانت عوائلهم خالية من هذا المرض (%33.3) (الاحتمالية ≤ 0.05). وكذلك اظهرت النتائج زيادة اصابة الاطفال الذين تعاني عوائلهم من الامراض الوراثية وخاصة مرض السكر بنسبة (53.3%) ومرض الانسمام الدرقي  بنسبة (%6.7) (الاحتمالية≤ 0.05)، مما يكشف عن وجود صله جينيه قويه بين مرض السكري والتهاب الغدة الدرقية مع مرض حساسية القمح.

2. وبالاستناد الى تصنيف مارش، فقد كشفت الدراسة عن زيادة كبيرة في اعداد المرضى الذين لديهم ضمور جزئي بزغابات الامعاء من الصنف Marsh Ш A)) وبنسبة(70%) من المرضى، مقارنة مع حالات الضمور الاقل من الكلي Marsh III Bوالضمور الكليMarsh IIIC فقد كانت اقل وبنسبة 13.3%, 16.7%)على التوالي)، في حين لم تظهر حالات Marsh I ولا Marsh II بين مجاميع مرضى الدراسة.

3. اظهر مرضى حساسية القمح ارتفاعا معنويا كبيرا في معدلات الاجسام المضادة IgA للجليادين (119.4± 83.8 وحدة/مل) (الاحتمالية≤0.05) بالمقارنة مع مجموعه التحكم (0.4±0.8 وحدة/مل)، في حين اظهرت الاجسام المضادة الموجهة ضد tTG اهمية احصائية عاليه في المرضى مقارنة مع مجموعة السيطرة (349.3±556.1 و0.9±0.5 وحدة/مل علي التوالي)، لم توجد فروق معنوية كبيرة (احتمالية> 0.05) للاجسام المضادة للجليادين والمضادة الموجهة ضد tTG مع الخصائص المختلفة للمرضى قيد الدراسة كالعمر، الجنس، مؤشر كتلة الجسم (BMI)، درجة القرابة بين الابوين، تأريخ المرض في العائلة، الامراض المزمنة في العائلة اضافة الى تصنيف مارش.

4. أظهرت الاجسام المضادة الموجهة ضد tTG فروقا معنوية كبيرة (احتمالية≤ 0.05) مع الزيادة التدريجيه في مستوي تلف الأمعاء والمصنفة من قبلMarsh Marsh IIIA) 202.5±345.6 وحدة/مل،IIIB  382.5 ± 255.5 Marsh وحدة/مل وIIIC  Marsh939.4±1022.8 وحدة/مل وعلى التوالي).

5. ارتفع متوســـــط تركــــــيز الانترلـــــــوكين 1-بيتا (IL-1β) في مصل المرضى ارتفاعاً طفيفاً (82.7 ±179.4 بيكوغرام /مل) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة (51.5 ±71.6بيكوغرام /مل) مع عدم وجود فروق معنوية كبيرة (احتمالية> 0.05). وكذلك اوضحت النتائج ان هناك زيادة طفيفه في مستوى التعبير الجيني لبروتينات الالتهابinflammasome NLRP3 في مرضى حساسية الحنطة (10.5±3.4) بالمقارنة مع مجموعه السيطرة (1.8±1.7)، ولم تظهر فروق احصائيه كبيرة (احتمالية>0.05) ما بين مستويات IL-1β ومستوى التعبير الجيني لبروتينات الالتهاب inflammasome  NLRP3مع جميع الخصائص السريرية (المذكورة سابقاً) لمرضى الدراسة.

6. أظهر تحليل ROC حساسية وخصوصية عالية لمضادات الجليادينIgA anti-gliadin ولمضادات انزيم الكلوتامينيز في النسيج anti-tTGفي مصل المرضى (100٪، 95 و91.7٪، 90 على التوالي)، اذ كانت المنطقة تحت المنحنى (AUC) للـ anti-gliadin أعلى وبشكل معنوي 0.99)) من (AUC) للـ anti-tTG  ((0.95. وقد أظهر التحليل الإحصائي(احتمالية<0.05 (ان العلاقة بين المعلمات السريرية لم تكن ذات دلالة إحصائية.  

وفي ختام البحث خلصت الطالبة الى التوصيات الاتية :

1. التحقق من دور التعبير الجيني لبروتينات الألتهاب NLRP3 Inflammasome في المرضى الذين يعانون من داء السكري أضافة للأضطرابات الهضمية وذلك للمقارنة مع أولئك الذين لديهم الاضطرابات الهضمية فقط.

2. إجراء  دراسة على مستوى زراعة الأنسجة عن طريق عزل الخلايا المعوية لمرضى الأضطرابات الهضمية  لقياس التعبير الجيني لبروتينت الألتهاب NLRP3 Inflammasome  .

3. يوصى بدراسة أنواع أخرى من جزيئات NLRP مثل NLRP1 ، ) NLRP4وذلك لأنها تشكل أيضًا بروتينات الألتهابات ، ولا زالت المعلومات عنها محدودة) والتحقق من دور التعبير الجيني الخاصة بهم واختيار الجزيئات الأكثر فعالية في تطور مرض الاضطرابات الهضمية.

4.  تقييم مستوى بروتينات NLRP3 Inflammasomeبواسطة تقنية الأمتزاز المناعي (ELISA)  لأيجاد مستوى هذا البروتين في مصل وبين تعبيره الجيني في مرضى الاضطرابات الهضمية.

5.  دراسة التعبير الجيني لـ IL-1β ومقارنته بمستوى في المصل.  ومن المثير للاهتمام دراسة دور    IL-18 إلى جانب IL-1beta في هذا المرض لكونه يلعب دورًا في الإمراضية.

6.  نوصي بالمزيد من الدراسات على NLRP3 كعامل حيوي كاشف عن وجود المرض وإمكانية استهدافه كعلاج.

   ---

   The Role of Inflammasome in Pathogenesis of Celiac Disease

   By Hiba Mouhsen Ali

   Supervised by Anwar Edrees Salman

   Aim of study

   The offered introduction promoted to inspect the role of NLRP3 inflammasome in a sample of Iraqi children with celiac disease through the context of some serological, immunological and immunogenetic factors; therefore the following aims were planned:

   Assessing the levels of IL-1β in the sera of celiac children and comparing it with the control group.

    Determine the NLRP3 Inflammasome gene expression level by using Real time quantitative PCR technique (RT-qPCR

   Follow the relationship between age, sex, height, weight, immunological factors and gene expression levels of inflammasome proteins

                                   Summary

   Celiac disease (or so-called wheat allergy) is an autoimmune disorder which is characterized by chronic inflammation that essentially affects the small intestine and is caused by eating gluten-containing foods. A current study was designed to identify some of the immune and genetic aspects in Iraqi patients with celiac disease. The study included 30 samples of children diagnosed with the celiac disease (male and female), were between 3-15 years of age whom attended to the consulting clinic at the Central Children’s Hospital, the Private Nursing Hospital and the Specialized Center for Endocrinology and Diabetes/ Al Kindi Hospital in Baghdad during the Period from August )2018( to March )2019(. They have been confirmed to be infected with celiac by serological examinations and intestinal endoscopy. In addition, the study included 20 healthy children with matched ages to patients, representing the control group who’s randomly selected from children with a negative history of autoimmune diseases

   Based on general characteristics, histological, serological and molecular examination, the study has been reached the following findings

   . Incidence of disease was observed in children aged (5-9) and (10-14) by 40% and 50%, respectively, and the number of infected females was 18 (60%) more than male 12 (40%), and the result showed that there was no significant difference (P >0.05). The study showed that the mean of (BMI) in patients was (15.4±2.2 Kg/m2) compared to (18.2±3.6 Kg/m2) in control group with a high significant difference (P≤0.05). Also in terms of weight, the mean of patients’weight was significantly lower than the control (22.9±7.2, 31.1±11.6 Kg, respectively) (P≤0.05). As for height, the highest average of patients was (120.8 ±16.8 cm) compared to the height in the control group (129.2 ±21.4 cm) with no significant difference (P>0.05).

   . The highest frequency of patients (73.3%) was noticed within the close relatives parents and followed by (26.7%) in non-relative parents with no significant differences (P>0.05). Also, the incidence of the disease in children with a family history of the diseases was much higher (66%) followed by children whose families were free of the diseases (33%) (P≤0.05). As well as, the present result showed that there was a high incidence of celiac disease in children whose parents are relatives of the first degree, as well as in the children having a family history of genetic diseases especially; diabetes and thyroidism(53.3%, 6.7% respectively). The study showed a high percentage for diabetes (P≤0.05), these results revealed a strong genetic link between diabetes and thyroidism with CD

   . Based on Marsh classification, results revealed that the majority of patients had partial villous atrophy (Marsh Ш A) of (70%), While that   percentage of children with subtotal and total villous atrophy (Marsh III B and III C) were lower than those with partial villous atrophy (13.3%, 16.7% respectively. Neither Marsh InorMarsh II was observed among study patients

   . The study showed that the highest mean of anti-gliadin IgA antibody in celiac patients (83.8±119.4 U/ml)(P≤0.05) as compared to control group (0.8±0.4 U/ml. Moreover, antibodies directed against tTGwas showed a high statistical significance between celiac patients and controls (349.3±556.1 and 0.9±0.5 U/ml respectively). However, no significant differences (P≥ 0.05) of anti-gliadine IgA and anti-tTG were observed with different characteristics of the patients under study such as age, sex, body mass index (BMI), kinship between parents, family history of the diseases, chronic diseases in the family as well as marsh classification. It was interesting that anti-tTG IgA showed a high significant difference (P≤0.05) with gradual increase in the level of intestinal damage classified by Marsh (Marsh IIIA, 202.5±345.6U/ml; Marsh IIIB, 382.5±255.5 U/ml and Marsh IIIC 939.4±1022.8 U/ml).Positive correlation was found between anti-tTG levels and modified Marsh grading

   . Results showed a slight increase in both IL-1β serum level of celiac patients(82.7±179.4 pg/ml) compared to controls (71.6±51.5 pg/ml) with no significant difference (P>0.05) and in the level of NLRP3 inflammasome gene expression in celiac patients (3.4±10.5) as compared to control group (1.7±1.8). The result showed that there was no statistical significant differences (P>0.05) were found between IL-1β levels and NLRP3 inflammasome gene expression level with the studied characteristics of celiac patients.

   . ROC analysis showed high sensitivity and specificity of anti-gliad in IgA and anti-tTG in the serum of celiac patients (100%, 95 and 91.7%, 90% respectively), whereas the area under curve (AUC) of anti-gliad in was (0.99) normally higher than (AUC) for anti-tTG (0.95). Results suggest that there was no significant correlation between clinical parameters of patients in the study (P>0.05). There are no significant relationship between the IL-1β serum level and the genetic expression of inflammatory proteins NLRP3inflammasome in celiac group, and that the relationship between the parameters  statistically was not significant.