قسم علوم الحياة يناقش رسالة ماجستير تبحث في في انظمة الدفق في بكتريا Escherichia coli المعزولة من التهابات المسالك البولية

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة (الكشف المظهري والجزيئي لأنظمة الدفق Efflux Pump  في بكتريا Escherichia coli المعزولة من التهابات المسالك البولية) في تخصص الاحياء المجهرية للطالبة  (زهراء حميد علوان) والتي انجزتها باشراف التدريسية في القسم (أ.د. رنا مجاهد عبد االله).

تهدف الدراسة للكشف عن أنظمة الدفق التي تمتلكها بكتريا E. coli المعزولة من التهابات المسالك البولية وعلاقتها بالمقاومة للمضادات الحيوية من خلال:

1. عزل وتشخيص بكتريا coli من بول المرضى الذين يعانون من التهابات المسالك البولية بالطرائق الزرعية و الكيموحيوية والجزيئية باستعمال الجين التشخيصي 16SrRNA.

2. اجراء اختبار فحص الحساسية Sensitivity Test لمجاميع مختلفة من المضادات الحيوية

3. اجراء اختبار قابلية البكتريا على انتاج الغشاء الحيوي Biofilm .

4. اجراء تجربة الكشف المظهري Phenotype عن مضخات الدفق Efflux Pumps .

5. الكشف الجيني Genotypeعن بعض جينات مضخات الدفق acrA و acrBفي بكتريا coli باستعمال تقنية PCR .

6. اجراء تجارب التحليل التتابعي DNA Sequencing للجين التشخيصي 16SrRNA و جيني المقاومة acrA و acrB .

اذ تم في هذه الدراسة جمع 100 عينة سريرية من بول المرضى الذين يعانون من التهابات المسالك البولية من عدة مستشفيات في بغداد شملت ( مستشفى مدينة الامامين الكاظمين (ع) التعليمي ، مستشفى الطفل المركزي التعليمي ومستشفى بغداد التعليمي والمختبرات التعليمية ومستشفى حماية الطفل التعليمي في مدينة الطب) ، للمدة من 10\7\2018 ولغاية 1\10\2018 .

      شخصت العزلات البكتيرية مظهريآ بعد زراعتها على الاوساط الزرعية التفريقية التي شملت ( وسط اكار المكونكي MacConkey agar  ، وسط اكار الايوسين مثلين الازرق Eosin Methylene Blue ،وسط اكار الدم Blood agar ، وسط اكار الكروماجين اورينتيشن Chromagar Orientation و وسط اكار الهكتون المعوي Hekton Enteric agar) ، بعدها اخضعت جميع العزلات الى الاختبارات الكيموحيوية Biochemical Test التي شملت ( اختبار الاوكسديز Oxidase Test ، اختبار الكتاليز Catalase Test ، اختبار اليوريز Urase Test ، اختبار الاندول Indol Test ، اختبار المثيل الاحمر Methyl Red Test ، اختبار استهلاك السترات Citrate Test ، واختبار الفوكس- بروسكاور Vogase-Proskauer ). واخيرا شخصت العزلات بصورة نهائية عن طريق التشخيص الجزيئي وذلك بالكشف عن الجين التشخيصي 16SrRNA. وبعد التشخيص تم الحصول على 50 عزلة سريرية تعود لبكتريا Escherichia coli المعزولة من التهابات المسالك البولية .

      اظهرت نتائج اختبار الحساسية للمضادات الحيوية ان بكتريا Escherichia coli كانت متعددة المقاومة للمضادات الحيوية من  النوع Multidrug Resistance ( MDR) ، فكانت 50 عزلة بنسبة (100%) مقاومة للمضاد الحيوي Carbenicillin ، 49 عزلة بنسبة (98%) مقاومة للمضاد الحيوي Erythromycin ،  47 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Rifampin بنسبة (94%)، 44 عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Ceftazidime بنسبة (88%)، 38عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Cefotaxime بنسبة (76%) ، 37عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Novobiocin بنسبة (74%) ، 33عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Tetracycline بنسبة (66%) ، 26عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Ciprofloxacin بنسبة (52%) ، 15عزلة مقاومة للمضاد الحيوي Gentamicin بنسبة (30%) و عزلتان مقاومة للمضاد الحيوي Nitrofurantoin بنسبة (4%) .

اظهرت النتائج ان 45عزلة بكتيرية بنسبة  (90%) كانت لها القابلية على تكوين الغشاء الحيوي Biofilm ، وبدرجات مختلفة ، فكانت عزلتان منها و بنسبة (4%) لها القابلية على الانتاج القوي للغشاء الحيوي Strong Adherent ، 6 عزلات بكتيرية بنسبة (12%) لها القابلية على الانتاج المتوسط للغشاء الحيوي Moderately Adherent و 37 عزلة بكتيرية بنسبة (74%) لها القابلية على الانتاج الضعيف للغشاء الحيوي Weakly Adherent .

اظهرت نتائج الكشف المظهري  Phenotypeعن مضخات الدفق Efflux Pumps ان 35 عزلة بكتيرية بنسبة (70%) كانت تمتلك مضخات الدفق .

تم اجراء الكشف الجيني Genotype للجينات acrA و acrB المشفرة عن بروتينات مضخات الدفق ، فقد بينت النتائج ان عدد العزلات البكتيرية التي تمتلك كل من الجين acrA و الجين acrB 49عزلة وبنسبة (98%) لكل منهما . و اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي ان الوزن الجزيئي للجين acrA  والجين acrB 107 زوج قاعدة و105 زوج قاعدة على التوالي .

بينت نتائج التحليل التتابعي لل DNA التابع للعزلة E27 بالنسبة للجينات acrA ، acrB و16SrRNA والتحليل التتابعي لل DNA التابع للعزلات E40 و E43 و E8 بالنسبة للجينات  acrA ، acrB و16SrRNA على التوالي انها كانت مطابقة بنسبة (100%) مع تتابع ال DNA في العزلات المسجلة عالميا في بنك الجينات الامريكي National Center for Biotechnology Information  .

وتوصلت الطالبة الى الاستنتاجات الاتية :

1. اظهرت جميع عزلات بكتريا coli المعزولة من التهابات المسالك البولية مقاومة متعددة للمضادات الحيوية Multigrug Resistance (MDR) ، فكانت اعلى مقاومة للمضاد الحيوي Carbenicilline بنسبة (100%) ، واقل مقاومة للمضاد الحيوي Nitrofurantoin بنسبة (4%) .

2. بينت نتائج الدراسة الحالية ان (90%) من عزلات بكتريا coli لها القابلية على انتاج الغشاء الحيوي (64%) Biofilm

3. اظهرت عزلات بكتريا coli نتائج موجبة للكشف المظهري عن انظمة الدفق Efflux Pumps بنسبة (70%) .

4. بينت نتائج الدراسة الحالية ان معظم عزلات بكتريا coli كانت تمتلك جينات المقاومة acrA و acrB التي تشفر عن بروتينات مضخات الدفق بنسبة (98%) لكل منهما .

5. بينت نتائج التحليل التتابعي للجينات 16SrRNA ،acrA و acrB انها كانت متطابقة بنسبة (100%) مع التحليل التتابعي لهذه الجينات ، وقد تم تسجيل الجينات في الموقع العالمي لبنك الجينات الامريكي (NCBI).

وخلصت الطالبة الى التوصيات الاتية :

1. اجراء العديد من الدراسات للكشف عن اسباب زيادة مقاومة بكتريا coli المعزولة من التهابات المسالك البولية للمضادات الحيوية من خلال الكشف عن جينات المقاومة للمضادات الحيوية وبالاخص تلك التي تشفر عن انظمة الدفق Efflux Pumps الاخرى .

2. اجراء العديد من الدراسات عن مثبطات انظمة الدفق Efflux Pump Inhibitors.

3. نشر الوعي الصحي عن عدم الاستعمال المفرط للمضادات الحيوية او استعمالها من دون وصفة طبية ، الامر الذي ينتج عنه ظهور سلالات بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية .

4. دراسة الكشف المظهري والجيني عن انظمة الدفق في الاجناس المرضية الاخرى السالبة والموجبة لصبغة كرام .

5. دراسة التعبير الجيني Gene Expression لجينات المقاومة المشفرة عن بروتينات انظمة الدفق باعتماد تقنية Real Time PCR.                                             

---

Department of Biology discusses MS.c. thesis on Phenotypic and molecular detection of Escherichia coli efflux pumps from UTI patients

By  Zahra’a Hameed Alwan 

Supervised by Asst.prof.Dr.Rana Mujahid Abdulla

The Abstract

One hundred of clinical samples were collected  from urine of patients with Urinary Tract Infections (UTIs) from several hospitals in the Baghdad city ( Alimameen Al-kadhimin Medical City , Central Child Teaching Hospital , Baghdad Teaching Hospital -Educational Laboratories – Child Protection Education Hospital in Medical City ) during the period from 10\7\2018 to 1\10\2018

                Bacterial isolates were identified by culturing on differential media (MacConkey Agar , Blood Agar , Eosin Methylene Blue Agar (EMB) , CHROMagar Orientation and Hekton Enteric Agar ) , then identified by biochemical tests including (Oxidase , Catalase , Urease , Indole , Methyl-Red , Citrate and Voges-Proskauer ) tests  The final identification was done by using molecular method by detecting of the 16SrRNA gene. After identification we obtained 50 isolates were belonged to Escherichia coli isolate from (UTIs) 

                The antibiotic susceptibility test showed that all isolates were Multidrug Resistance (MDR) , were high resistant to Carbenicillin50(100%) , Erythromycin 49(98%) , Rifampin 47(94%) , Ceftazidime44(88%) , Cefotaxime38(76%) , Novobiocin37(74%) ,Tetracycline 33(66%) ,Ciprofloxacin 26(52%) , Gentamicin 15(30%) and Nitrofurantoin2(4%) 

                The prevalence of bio film producer bacterial isolates was 45(90%) that 2(4%) produced strong, 6(12%) produced moderate and 37(74%) produced weakly bio film 

                The phenotypic detection of efflux pumps was appeared in 35(70%) of bacterial isolates

                Genotypic detection of efflux pump genes revealed that The frequency of the acrA and acrB genes were 49(98%) each of them ,and the gel electrophoresis showed that the molecular weight of the gene was 107bas pair and 105 base pair to each of them 

                The results of DNA sequencing analysis of 16SrRNA , acrA and acrB genes from E27 isolate , and the results of DNA sequencing analysis of  these genes from E40 , E43 AND E8 Respectively revealed that  these genes were (100%)similar to the DNA Sequences of the isolates in National Center for Biotechnology Information