Preaload Image

قسم علوم الحياة يناقش رسالة ماجستير تخليق جسيمات اوكسيد الزنك النانوية حيوياً من بكتريا الزائفة الزنجارية المعزولة من مصادر مختلفة

Print Friendly, PDF & Email

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة ( التخليق الحيوي لجزيئات أوكسيد الزنك النانوي بوساطة بكتريا الزائفة الزنجارية المعزولة محلياً ) للطالب (ذو النون يونس صالح ) التي انجزها تحت اشراف التدريسي في القسم (أ.م.د. عصام جاسم الخليفاوي).

وتهدف هذه الدراسة الى تخليق جسيمات اوكسيد الزنك النانوية حيوياً من بكتريا الزائفة الزنجارية المعزولة من مصادر مختلفة ومن ثم دراسة تأثير هذه الجسيمات المخلقة في بعض عوامل الضراوة لبكتريا الزائفة الزنجارية.

تم جمع 104 عينة (Swab) من عدة مصادر سريرية وبأعمار مختلفة وللمدة مابين 9/12/2018 الى 3/3/2019 ومن مستشفيات مدينة الطب في بغداد (مستشفى بغداد التعليمي، مستشفى غازي الحريري، مستشفى الحروق، المختبرات التعليمية).

تم الحصول على 58 عزلة تعود لبكتريا الزائفة الزنجارية. أستخدم جهاز Vitek compact system 2  من أجل تحديد قيم التراكيز المثبطة الادنى لثلاثة عشر مضاداً حيوياً لثلاثين عزلة إذ كانت العزلات مقاومة بنسبة كبيرة لكل من مضادي Colistin و Tobramycin وبمعدل 53.3 % وبواقع 16 عزلة لمضاد Colistin وبمعدل 56.7 % وبواقع 17 عزلة لمضاد Tobramycin.

تم الكشف عن قابلية بكتريا الزائفة الزنجارية على تكوين عوامل الضراوة إذ كانت 18 عزلة من اصل ثلاثين مكونة لصبغة البايوسيانين في حين كانت جميع العزلات قيد الفحص لها القابلية على احلال الدم من نوع بيتا وعند الفحص على مقدرة البكتريا على انتاج انزيم البروتييز لوحظ ان 25 من اصل ثلاثين عزلة كانت تملك قابلية تكوين انزيم البروتييز وبمعدل اقطار يتراوح مابين 12-20 مليمتر اما عند الكشف عن قدرة البكتريا على انتاج حاملات الحديد فقد كانت جميع العزلات منتجة لحاملات الحديد وعند دراسة مقدرة البكتريا على تكوين الغشاء الحيوي أعتمدت طريقتان للكشف الاولى باستعمال وسط الكونغو الاحمر والغرض من هذا الفحص دراسة قدرة البكتريا على تكوين خلايا الالتصاق إذ كانت جميع العزلات مكونة لهذه الطبقة ولكن بنسب مختلفة فقد وجد ان 53 %  من البكتريا كانت شديدة التكوين لهذه الطبقة بناءً لأمتلاكها لوناً اسود غامقاً بعد النمو و47 % كانت متوسطة التكوين.

اما الطريقة الثانية فتمت بأعتماد اطباق المعايرة الدقيقة فكانت النتائج في امتلاك جميع العزلات قيد الدراسة القابلية على تكوين الغشاء الحيوي وبدرجات مختلفة مقارنة مع السيطرة السالبة حيث كانت 14 عينة ضعيفة التكوين و 12 عينة متوسطة التكوين واربع عينات شديدة التكوين.

تم بعد ذلك اختيار العزلة الاكثر مقاومة للمضادات الحياتية من اجل استعمالها في التخليق الحيوي لجسيمات أوكسيد الزنك النانوية استعمل كبريتيد الزنك ككاشف تحليلي اضيف للراشح البكتيري إذ تمت عملية اختزال لكبريتيد الزنك لتكوين اوكسيد الزنك النانوي. يعد ظهور راسب ابيض في قعر دورق الاختبار دليلا على عملية التحول هذه.

تم دراسة خصائص المادة النانوية الناتجة باعتماد اجهزة التشخيص المتمثلة بجهاز مطيافية الاشعة فوق البنفسجية ومجهر القوى الذري وجهاز حيود الاشعة السينية ومطيافية فيورية للاشعة تحت الحمراء فضلا عن كل من المجهر الالكتروني الماسح و جهاز حساب فرق جهد زيتا المحتملة كانت النتائج لهذه الاجهزة تشير الى تكون جسيمات أوكسيد الزنك بصورة نقية وباشكال مختلفة واحجام تتراوح مابين 20 -100 نانوميتر.

اختبرت فعالية الجسيمات النانوية المخلقة ضد بكتريا الزائفة الزنجارية إذ تم الاعتماد على ثلاثة تراكيز مختلفة (0.01 ،0.1 ،0.5 ) ملغم / مل وقد اظهر التركيزان 0.1 و 0.5 فعالية في تثبيط نمو البكتريا في حين لم يعط تركيز 0.01 أية فعالية.

تم دراسة قدرة الجسيمات النانوية المخلقة في تثبيط بعض عوامل الضراوة لبكتريا الزائفة الزنجارية إذ تم دراسة قدرة جسيمات أوكسيد الزنك النانوية على تثبيط انتاج الغشاء الحيوي تم معاملة جميع العزلات المنتجة للغشاء الحيوي بتركيزين من المادة النانوية وهما(0.1 ،0.5 ملغم / مل) كلا على حدة إذ تم اضافة 100 مايكروليتر من التراكيز الى 100 مايكروليتر من العالق البكتيري في اطباق المعايرة ومن ثم حضنها لمدة 24 ساعة ومن ثم اكمال خطوات قراءة النتائج اظهرت النتائج ان نسبة التثبيط في تركيز 0.5 كانت الاكبر وبنسبة 83.8 % في حين كانت نسبة التثبيط في تركيز 0.1 (80 %).

اختبرت ثمان عزلات من العزلات البكتيرية المقاومة للعديد من المضادات الحياتية باستعمال الجسيمات النانوية لغرض الكشف عن قدرة هذه الجسيمات على تثبيط انتاج الهيمولايسين وتم استعمال تركيزين هما 0.5 و 0.1 ملغم/مل زرعت العزلات على وسط اكار الدم الحاوي على الجسيمات النانوية إذ لوحظ في تركيز 0.5 ان جميع العزلات فقدت مقدرتها على انتاج الهيمولايسين نوع بيتا وتحولت الى منتجة للهيمولايسين نوع الفا في حين ان تركيز 0.1 بقيت العزلات قادرة على تكوين الهيمولايسين نوع بيتا.

تم دراسة تأثير جسيمات أوكسيد الزنك النانوية على انتاج صبغة البايوسيانين  لمجموعة من العزلات المقاومة للعديد من المضادات الحيوية (ثمان عزلات) لبكتريا الزائفة الزنجارية وتم استعمال تركيزين هما 0.5 و 0.1 ملغم / مل زرعت العزلات على وسط نقيع القلب والدماغ  الحاوي على الجسيمات النانوية إذ لوحظ في تركيز 0.5 ان جميع العزلات فقدت مقدرتها على انتاج الصبغة في حين ان تركيز 0.1 عينتان فقط كانت قادرة على فقدان الصبغة.

ايضاً تم اجراء تجربة الكشف عن تأثير جسيمات أوكسيد الزنك النانوية في انتاج انزيم البروتييز لبعض العزلات المقاومة لعديد من المضادات الحياتية لبكتريا الزائفة الزنجارية وباستعمال تركيزين هما 0.5 و 0.1 ملغم/ مل على وسط اكار الحليب إذ لوحظ انه في تركيز 0.5 قلت نسبة انتاج انزيم البروتييز في حين لم تتأثر في تركيز 0.1 غم/مل.

واخيراً تم اجراء تجربة الكشف عن تأثير جسيمات أوكسيد الزنك النانوية في انتاج حاملات الحديد لبعض العزلات المقاومة لعديد من المضادات الحياتية لبكتريا الزائفة الزنجارية وباستعمال تركيزين هما 0.5 و 0.1 ملغم/ مل على وسط الاكار المغذي الحاوي على الجسيمات النانوية إذ لوحظ في كلا التركيزيين ان جميع العزلات المستعملة في التجربة قد ضعف انتاجها لحاملات الحديد.

الاستنتاجات

  • بينت نتائج الدراسة تنوع مصادر الاصابة المسببة لعديد من الامراض لبكتريا الزائفة الزنجارية إذ كانت اكبر نسبة للعينات التي تم جمعها في عينات البول واقل نسبة لوحظت في الخراجات والدم.

  • أظهرت جميع العزلات البكتيرية التي تم دراستها مقاومة متباينة للمضادات الحيوية عند الفحص في جهاز vitek compact2 ، اعلى مقاومة كانت لمضاد Tobramycin وColistin واقل نسبة مقاومة كانت لمضاد Piperacillin/Tazobactam.

  • لوحظ من خلال اجراء التجارب للكشف عن عوامل الضراوة للبكتريا امتلاك جميع العزلات لعوامل الضراوة قيد موضوع الدراسة فيما عدا امتلاكها لصبغة البايوسيانين وانزيم البروتييز إذ وجدت بنسب مختلفة اقل.

  • عند الكشف على قابلية البكتريا على تكوين الغشاء الحيوي اظهرت النتائج ان جميع العزلات تملك قابلية تكوين الغشاء الحيوي ولكن بنسب مختلفة .

  • نجحت الدراسة في التخليق الحيوي لجسيمات أوكسيد الزنك النانوية من بكتريا الزائفة الزنجارية.

  • اكدت الفحوصات التي تم اجراؤها على المادة المخلقة انها مادة نانوية ونقية وذات اشكال واحجام متعددة ويتراوح حجمها مابين 20-100 نانوميتر وكان معدل الحجم المستحصل 30 نانوميتر.

  • اثبتت جسيمات أوكسيد الزنك النانوية المخلقة قدرتها على تثبيط بعض عوامل الضراوة التي تم دراستها .

التوصيات

  • اخذ الاحتياطات عند اختيار المضادات الحيوية من اجل منع تطور مقاومة البكتريا للمضادات المتعددة.

  • التحقق من دور جسيمات أوكسيد الزنك النانوية من الـتأثير على عوامل ضراوة بكتريات أخرى.

  • دراسة تأثير جسيمات أوكسيد الزنك النانوية في التعبير الجيني لجينات الاغشية الحيوية والجينات المسؤولة عن عوامل الضراوة الاخرى في بكتريا الزائفة الزنجارية او في بكتريات اخرى.

  • اللجوء الى استخدام مواد اخرى غير مادة كبريتيد الزنك المستخدمة كمادة خام في عملية تخليق جسيمات أوكسيد الزنك النانوية.

  • تجربة كائنات مجهرية اخرى في عملية تخليق جسيمات أوكسيد الزنك النانوية.

  • دراسة مدى سمية جسيمات أوكسيد الزنك من خلال تجربتها على الحيوانات المختبرية.


Biosynthesis of Zinc Oxide Nanoparticles by Pseudomonas aeruginosa Locally Isolated

By Thooalnoon Younes Saleh Al-Janabi

Supervised by Asst.prof. Dr. Esam J. Al-Kalifawi

This study aimed to synthesize bio-zinc oxide nanoparticles from Pseudomonas aeruginosa bacteria from different sources and then study the effect of these synthetic particles on some virulence factors of Pseudomonas aeruginosa bacteria

104 swab samples were collected from different clinical sources of different ages and for the period from 9/12/2018 to 3/3/2019 and from the Medical City Hospitals in Baghdad (Baghdad Teaching Hospital, Ghazi Hariri Hospital, Burns Hospital, and Educational Laboratories).After microscopic and biochemical tests, 58 isolates were obtained from Pseudomonas aeruginosa

Vitek compact system 2 was used to determine the minimum inhibitory concentrations of thirteen antibiotics for 30 isolates, where the isolates were highly resistant to Colistin and Tobramycin at 53.3%, 16 isolate Colistinand 56.7% with 17 isolate to Tobramycin

Then, the ability of Pseudomonas aeruginosa bacteria to develop virulence factors was detected. 18 out of thirty isolates were composed of the pyocyanin pigment.While all the isolates under investigation had the ability to replace blood type beta to alpha. When examining the ability of bacteria to produce protease enzyme, it was observed that 25 out of thirty isolates possessed the ability to form protease enzyme at a rate of diameters ranging from 12-20 mm.

When isolating the ability of bacteria to produce iron carriers, all isolates were produced for iron carriers. In the study of the ability of bacteria to form a biofilm, two methods were used to detect the first using Congo red agar method the purpose of this test was to study the ability of bacteria to form adhesion cells. All the isolates were made up of this layer, but in different proportions, it was found that 53% of the bacteria were highly formed according to the possession of a dark black color after growth and 47% were medium composition.

The second method was done using micro titer plate. The results showed that all the isolates under study had the ability to form the bio film to varying degrees compared to negative control where 14 samples were poorly formed, 12 were medium formation and four were highly formed.

The most antibiotic-resistant isolation was then selected for use in the biosynthesis of zinc oxide nanoparticles. The appearance of a white precipitate at the bottom of the test flask is evidence of this transformation.

The properties of the resulting nanomaterials were studied using diagnostic devices such as UV spectroscopy, atomic force microscope, X-ray diffraction, infrared spectroscopy, scanning electron microscopy and zeta potential .The results of these devices indicate the formation of zinc oxide particles in pure and different forms and sizes ranging from 20 to 100 nanometers.

The activity of synthetic nanoparticles was tested against Pseudomonas aeruginosa bacteria, where three different concentrations (0.01, 0.1, and 0.5) mg / ml were used.Concentrations of 0.1 and 0.5 showed efficacy in inhibiting bacterial growth while 0.01 gave no activity.

The ability of synthetic nanoparticles to inhibit some virulence factors of Pseudomonas aeruginosa bacteria was studied.The ability of zinc oxide nanoparticles to inhibit the production of biofilm was studied.

All the biofilm-producing isolates were treated with two concentrations of nanomaterials (0.1, 0.5 mg / ml) separately. Where 100 ul of concentrations were added to 100 ul of bacterial suspension in the micro titer plates and then incubated for 24 hours and then complete the steps to read the results. The results showed that the inhibition rate at the concentration of 0.5 was the largest by 83.8%, while the inhibition at the concentration 0.1 was (80%).

Eight isolates of several antibiotics resistant’s were tested using nanoparticles to detect the ability of these molecules to inhibit the production of hemolysin.

Two concentrations of 0.5 and 0.1 mg / mL were used the isolates were planted on the nanoparticle-containing blood medium, where it was observed at 0.5 concentration that all isolates lost their ability to produce beta hemolysin and became alpha-hemolysin-producing while 0.1 isolates remained able to form beta-hemolysin

The effect of zinc oxide nanoparticles on the production of pyocyanin dye was studied for a group of isolates resistant to several antibiotics (eight isolates) of Pseudomonas aeruginosa bacteria. In Concentration 0.5 all isolates lost their ability to produce dyewhile in the concentration of 0.1 only two samples were able to dye loss.

An experiment was conducted to detect the effect of zinc oxide nanoparticles on the production of protease enzyme for some isolates resistant to many antibiotics of Pseudomonas aeruginosa bacteria using two concentrations:

0.5 And 0.1mg/ml on the milk agar where it was observed at a concentration of 0.5 decreased the proportion of enzyme production while proteases were not affected at a concentration of 0.1 mg / ml.

Finally, an experiment was carried out to detect the effect of zinc oxide nanoparticles on the production of Siderophores for some isolates resistant to many antibiotics of Pseudomonas aeruginosa bacteria using two concentrations of 0.5 and 0.1 mg / ml on the nutrient agar containing nanoparticles.It was observed that in both concentrates all the isolates used in the experiment had weakened their production of Siderophores