Preaload Image

قسم علوم الحياة يناقش اطروحة دكتوراه تبحث في توصيف الخط الخلوي للخلايا السرطانية الكبدية (HCAM)

Print Friendly, PDF & Email

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) اطروحة الدكتوراه الموسومة (توصيف الخط الخلوي للخلايا السرطانية الكبدية ((HCAM والمعزولة محلياً من اورام الجهاز الهضمي للفئران ) للطالب ( ايمن راضي حبيب راضي ) التي انجزها تحت اشراف التدريسية في القسم (أ. م. د. بيداء حسين مطلك ) و (أ. م. د.  احمد مجيد الشمري ).

ونوقشت الاطروحة من قبل اعضاء لجنة المناقشة المدرجة اسمائهم فيما يلي :

ا.د. انوار ادريس سليمان                      رئيسا

أ.د. غسان محمد سليمان                    عضوا

ا. م. د فاروق ابراهيم محمد                  عضوا

أ.م.د. انتظار محمد مناتي                     عضوا

ا. م. د محمد مهدي جواد                     عضوا

ا. م. د بيداء حسين مطلك                   عضوا و مشرفا

ا. م. د احمد مجيد الشمري                 عضوا و مشرفا

وتهدف الدراسة الى دراسة خصائص الخط الخلوي لسرطان الكبد والمعزول محلياً من اورام الجهاز الهضمي.

واشار الطالب الباحث الى ان دراسة خصائص الخط الخلوي لسرطان الكبد في الفئران Hepatic Cancer Ahmed Majeed    (HCAM) تعد وسيلة مهمة في أبحاث سرطان الكبد. لقد أنشئ هذا الخط الخلوي من ورم اصاب كبد الفئران البيض السويسرية  Mus Musculus. لقد هدفت التجارب المختلفة للدراسة الحالية الى وصف خط الخلايا السرطانية الكبدية HCAM ، والتي تشمل الاتي:

      تنمية الخط الخلوي لسرطان الكبد في احدى الاوساط الزرعية RPMI-1640  وتمت عملية الزرع الثانوي واجراء التمريرات اللازمة كل 48- 72 ساعة. تمت دراسة منحنى النمو ولتمريرات مختلفة (5 -9  – 12)  ولاعداد الخلايا (10000 خلية / مل) اذ كان طور السكون lag phase  في 24 ساعة بينما الطور اللوغارتمي Log phase  بين 72 – 144 ساعة ووصلت اعداد الخلايا الى طور الانحدار تدريجيأ من 168  – 240 ساعة فضلأ عن حساب زمن تضاعف الخلايا Population Doubling Time (PDT) اذ كان 17 ساعة.

      اظهرت الدراسة الوراثية الخلوية للخلايا السرطانية وللتمريرات الاتية (7- 8-12 )  تشوهات كروموسومية وتغيرات عددية فيما بينها, ومن هذه التغيرات التركيبية هي :الطول الغير طبيعي , تكسر اذرع الكروموسومات وغيرها.

      اظهرت الدراسة المظهرية للخلايا السرطانية وباستعمال المجهر مقلوب العدسة Inverted microscope وباستعمال ملون الهيماتوكسلين – ايوسين و الصبغة البنفسجية البلورية crystal violet  وللتمريرات (6 ,  9 , 14) ان الخلايا تكون بشكل متعدد الاضلاع مشابهة للخلايا الظهارية في النمو داخل قارورة الزرع النسجي, كذلك اظهر الفحص المجهري ان الخلايا تمتلك نواة مركزية ونويات متعددة فضلا عن نسبة السايتوبلازم الى النواة.

        من ناحية اخرى اظهرت دراسة الكيمياء الخلوية المناعية للخلايا السرطانية ICC))Immunocytochemistry  وللتمريرات الاتية  (17, 15 , 13) في شرائح الزرع النسجي الكشف عن بعض الانزيمات المناعية. منها : الانزيم P53  والذي اعطى نتيجة ايجابية واضحة ,الانزيم Epidermal growth factor receptor (EGFR)  اعطى نتيجة ايجابية , اما الانزيم (Human epidermal growth factor receptor (HER2/neu اعطى نتيجة ايجابية ضعيفة.

        تم تعريض الخلايا السرطانية للكبد وللتمريرات الاتية (16 , 19 , 21) الى نوعين من العلاجات الكيميائية ( السيسبلاتين 50 ميكروغرام/ مل , الدوسيتاكسل 100 مايكروغرام / مل ) ولمدة 72  ساعة وقد اظهرت نتائج الدراسة ان السمية الخلوية لخلايا سرطان الكبد كانت اكثر حساسية للمادتين الكيميائية بعد ذلك تم تعريض الخلايا الجنينية الليفية للفئران للمادتين الكيميائية ولنفس التركيز والمدة وقد بينت نتائج الدراسة كون الخط الخلوي لل Mouse embryonic fibroblast (MEF) كان اكثر مقاومة للمادتين الكيميائية.

        اظهرت الدراسة بعض التغيرات المظهرية عن طريق تصبيغها بملون الهيماتوكسلين ايوسين فقد لوحظت بعض التغيرات المظهرية للخلايا السرطانية الكبدية بعد تعرضها للمادة الكيميائية وبتركيز IC50  (السيسبلاتين10.74 µg/ ml  والدوسيتاكسل12.82 µg/ ml   ) ولمدة 72  ساعة. ومن هذه التغيرات هو تحلل الغشاء الخلوي للخلايا ,انكماش النواة وضمور بعض الخلايا والشكل غير المنتظم لبعض الخلايا وتفجي السايتوبلازم فضلا عن وجود فسح كبيرة بين الخلايا.

       وبينت الدراسة الوراثية الجزيئية للخلايا السرطانية المزروعة باستعمال تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدي نتيجة ايجابية للمورث  p53 وβ-actin  وسلبية للمورث الكلوبينβ-globin .

      كذلك بينت نتائج التسلسل الجيني للمورث  p53 في خلايا سرطان الكبد للفئران البيض ومن خلال المركز الوطني لمعلومات التقانة الاحيائية NCBI  ان هنالك تطابق بنسبة 94-99 % بين اثنين من التسلسل الجيني للمورث .p53 

التوصيات

1- انشاء خط خلوي لسرطان الكبد عن الانسان او خطوط خلوية سرطانية لاحد اعضاء الجهاز الهضمي للمرضى العراقيين.

2- دراسة تشخيصية لخط خلوي سرطاني جديد مثل سرطان المرئ , المعدة والقولون من خلال اجراء دراسة وراثة خلوية ومناعية فضلاً عن الدراسة الوراثية الجزيئية.

3- استخدام تقنيات جديدة للدراسة الوراثية الخلوية مثل FISH, SKY, GCH .

4- دراسة التعبير الجيني لبعض انواع الجينات بوساطة تقنية RT-PCR بعد معاملة الخلايا السرطانية بالعلاج الكيميائي.

5- دراسة السمية الخلوية لانواع اخرى للخطوط الخلوية السرطانية.        


Characteristics study of cancer cell line isolated locally from digestive system tumors

By Ayman Radhi Habeeb

Supervised by Asst.prof.Baida’a H.Mutlak and Ahmed Majeed Al-Shumari

       The characterization study of murineHepatic Cancer Ahmed Majeed(HCAM) is considers as a useful tool in research of liver cancer. This cell line was established from tumor of a white Swiss albino mouseMusMusculus. The different experiments of present study targeted to characterize HCAM cancer cell line, which are:

The continuous subculture characterization of the grown cell cultured in tissue culture flask each 48- 72 hours. studying the growth kinetics for different cells number of HCAM (10,000 cells /1ml) at several passages 5, 9 and 12, and calculating population doubling time that have been 17 hours .The lag phase was identical for the curves 24hr, while the ranging of log phase from 72- 144 h, where the decline phase beginning at 168 h

The cytogenetic results of HCAM cell with passages 7, 8 and 12 revealed chromosomal variation with many numerical changes among the cancer cells along with structural changes including telocentric, abnormal length, and breaks in the arm of chromosomes

 The morphological study was carried out by using crystal violet, and hematoxylin&eosin with passages (6, 9 and 14). The cells were elongated multi-polar epithelial- like with central nucleus, multi-nuclei and clear vacuoles in cytoplasm

Epidermal growth factor receptor (EGFR), HER2-neu and P53 protein were detected using immunocyto chemistry in HCAM tumor cells at 13, 15 and 17 passage and the results were positive compared to negative control         

HCAM cells at several passages 16, 19 and 21 were exposed to chemotherapy agents with serial dilutions, as the following Cisplatin 50, 25, 12.5, 6.25 and 3.125 µg/ml and Docetaxel 100, 50, 25, 12.5, 6.25 µg/ml for 72 h to determine the inhibition rate of cancer cells and compared with MEF cell line after exposure to Cisplatin and Docetaxel at the same concentrations and duration.                                                                                 

The inhibition rate measured all treated and untreated cells which were 65.4, 60.1, 56.4, 52.6 and 47.0 % by Cisplatin and 59.6, 57.2, 51.4, 42.9 and 37.5% by Docetaxel.All these concentrations of chemotherapy agent were had inhibitory effect on HCAM cells and the results revealed that HCAM cell were sensitive to Cisplatin and Docetaxel, While MEF cell after being exposed to Cisplatin and Docetaxel, showed resistance to chemotherapy compared with HCAM cells

Analysis of changes in cell morphology was evaluated using hematoxylin and eosin staining .Many morphological changes were characterized on HCAM cancer cells after exposure to IC50 concentration of chemotherapy (Cisplatin&Doetaxel), the morphological changes represented by the volume and shape of the nucleus/cytoplasm ratio ,degeneration, and Irregular shape of cells and shrink of nucleus

In addition, the present study conducted the PCR and DNA sequencing of some genes, The P53 gene product exhibited specific band at 500 bp and β-actin gene product exhibited band at 400 bp on gel electrophoresis whereas, the β-globin gene product showed no specific band on the gel electrophoresis. Based on P53 gene product partial sequencing NCBI blast result, it showed similarity with two partials sequenced P53

Establishment of human hepatocellular carcinoma cell line or other digestive tumor cell lines from Iraqi patients

– Characterization study for new digestive cancer cell lines such as esophagus, stomach and colon cell lines by the detection of ICC, cytogenetic, cytotoxicity and molecular studies

– Using other techniques to observe the chromosomal alterations                     such as Spectral Karyotyping(SKY),Fluorescence in situ hybridization(FISH) and Comparative Genomic hybridization(GCH).

– Measure the level of some genes expression in cancer cell after treatment with chemotherapy agents by RT-PCR.

– Conducting further cytotoxic in-vitro studies on the other digestive                                       tumor cell lines.

–              Studying the angiogenesis process in-vivo by initiating tumors by implantation of (HCAM) cells in the laboratory animals, then examin the effects of angiogenesis inhibiter by tested many anti-angiogenesis therapies according to tumor size and distance metastasis in laboratory animals.