قسم علوم الحياة يناقش رسالة ماجستير تبحث في التغاير الجيني في الجينات Super Oxide Dismutase لدى مرضى إلتهابات الأمعاء العراقيين

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة ( التغاير الجيني في الجيناتSuper Oxide Dismutase   وعامل التنخر الورميTumor Necrosis Factor في مرضى إلتهابات الأمعاء العراقيين ) للطالبة (ايناس فاضل رشيد  ) التي انجزتها تحت اشراف التدريسية في القسم ( أ.م.د. وفاء صبري ماهود ).

ونوقشت الرسالة على قاعة المرحوم أ. سالم عبد الحميد من قبل اعضاء لجنة المناقشة :

• أ.د. ابراهيم هادي محمد رئيسا

• أ.م.د. عذراء حميد حسون عضوا

• أ.م.د. حازمة موسى خليل عضوا

• أ.م.د. وفاء صبري ماهود عضوا ومشرفا

تهدف الدراسة الحالية البحث في التغايرات الوراثية Genetic Polymorphisms  في الجين المشفر لمضاد الأكسدة ((SOD1   Super Oxide  Dismutase  وكذلك التغاير الوراثي للجين المشفر لعامل التنخر الورم  Tumor Necrosis Factor alpha (TNF- α)   ضمن منطقة المحفز  Promoter region  -1031))  في بعض المرضى العراقيين المصابين بالتهابات الامعاء  IBD لما لها من اهمية كبيرة في نشوء وتطور هذا المرض ولإرتباط هذا المرض في حدوث الأورام والسرطانات التي تصيب القناة الهضمية.

       إلتهاب الأمعاء Inflammatory Bowel Disease (IBD) مرض مزمن يشمل نوعين مهمين هما التهاب القولون التقرحي Ulcerative Colitis (UC)  الذي يصيب جزء من القناة الهضمية في الأمعاء الغليظة وهو القولون و داء كرونز Crohn’s Disease(CD) الذي ممكن أن يصيب أي جزء من القناة الهضمية من الفم حتى المخرج وعلى الرغم من ان اسباب المرض لم تحدد بالضبط الا أن الدراسات اثبتت أنه يحدث بسبب تداخل العوامل الوراثية مع عوامل البيئة الخارجية والداخلية للمصاب مسبباً استجابة مناعية غير طبيعية للطبقة المخاطية للامعاء إتجاه المستضدات الموجودة داخل جوف الأمعاء lumen.

    تضمنت هذه الدراسة جمع عينات دم من المرضى المراجعين لمركز أمراض الجهاز الهضمي والكبد / مدينة الطب في مدينة بغداد للمدة (أيلول – كانون الأول /2018) وتم التحري عن التغايرات الوراثية في هذه الجينات بتقنية تنوع أطوال المادة الوراثية المجزأة Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) وتقنية إيجاد التتابع النيوكليوتيدي Sequencing. شملت الدراسة 75 عينة دم تم سحبها من المرضى المصابين بإلتهابات الأمعاء بعد التأكد من تشخيص المرض من قبل الطبيب الاخصائي فضلا عن  20 عينة تم سحبها من الأصحاء (Healthy Control  (HC كمجموعة ضابطة لغرض المقارنة  وحفظت العينات في انابيب EDTA  tubes  بالتبريد لحين الاستعمال .

       أظهرت النتائج وجود فرقاً معنوياً عالياً (p<0.01) إعتماداً على بعض الخصائص السريرية للمرضى إذ كانت نسبة الإصابة 43(57%)   32(43%)عند الإناث والذكور على التوالي وكانت نسبة الإصابة  14(19%) 61(81%)  للأعمار الأقل من 50 وأكبر من 50 على التوالي وكانت نسبة الإصابة بإلتهاب القولون التقرحي عالية 45(62.7%) بالمقارنة مع نسبة الإصابة بداء كرونز   30(37.3%)مع وجود فرقاً معنوياً كبيراً.

تم الكشف عن  التغاير الوراثي في جين SOD 1 +A35/C (rs2234694)   لما له من دور كبير في امراضية التهابات الامعاء وهي منطقة مجاورة لنقطة القطع بين اكسون 3 وانترون 3  ((exon3/intron3 ذات الصلة بالنمط الجيني AA الذي يشفر الى انزيم عالي الفعالية اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي عبر هلام الاكروز لقطع DNA  لجينSOD1 المضخم بتقنية PCR  والمقطع بالأنزيم  القاطع    HhaI ان هناك قطعة واحدة بحجم (278) زوج قاعدي للنمط الوراثي AA كما اظهرت نتائج هذه الدراسة نسبة عالية للنمط الجيني Homozygous A Genotype في مرضى IBD بلغت (94.67%) مقارنة مع المجموعة الضابطة (75%) (p=0.0093,Chi=7.149**,OR=1.095) وبذلك سجل النمط الجيني المتماثل AA فرقاً معنوياً عالياً مابين المرضى المصابين بIBD  والاصحاء, اما النمط الجيني Homozygous CC Genotype لم يظهر في كل من مرضى IBD  والمجموعة الضابطة وقد أظهر النمط الجيني Heterozygous A>C Genotype  ثلاث قطع بأحجام مختلفة278,207,71) ) زوج قاعدي وقد سجل نسبة اقل في مرضى الـ IBD (5.33%) مقارنة بـ  (25%) في الاصحاء HC p=0.0093,Chi=7.149**,OR=1.095),)  وبذلك سجل النمط الجيني A>C فرقاً معنوياً بين المرضى المصابين بـIBD  والاصحاء . اما نتائج التكرار الاليلي فقد اشارت الى زيادة ترددات الاليل  (1) (0.94)A  مقارنة مع الاليل (0.06) C  (0) في الذكور والاناث على التوالي, كما اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي عبر هلام الاكروز لقطع DNA  لجين TNF-α   1031 – المضخم بتقنية PCR  والمقطع بالأنزيم  القاطع    Bbslان هناك احجام مختلفة من قطع DNA دلالة على وجود أنماط جينية مختلفة إذ  ظهرت قطعتين بحجم (251,13) زوج قاعدي للنمط الوراثي TT وكانت نتائج الاليل TT Homozygous T Genotype -1031T  في مرضى  62.67% IBD مقارنة مع المجموعة الضابطة14/20) 70% )          مع عدم وجود فروقات معنوية,ChI=3.091 ,OR=0.377)  0.061=P). اما النمط الجيني Homozygous C Genotype فقد اعطى قطعتين بحجم (180,71)  زوج قاعدي  وكان بنسبة 5.33%    في مرضى IBD مقارب لنسبته في المجموعة الضابطة 5%  ChI=0.055 NS, OR=0.0162)  0.872 ,=P) ,أما النمط الجيني Heterozygous Genotype  TC فقد اعطى ثلاثة قطع باحجام ((251,180,71 زوج قاعدي  IBD ولم يظهر فرق معنوي بالرغم من ظهور نسبة عالية في المرضى   24(32%)مقارنة بالأصحاء 5(25%) P=0.069 , ChI=2.983  OR=0.352) )  بينت نتائج الدراسة الحالية أن نسبة التكرار الأليلي للأليل T للجين  TNF-αإعتمادا على قانون هاردي وينبرغ كانت عالية إذ بلغت في المرضى 79% مقارنة بالأليل C الذي بلغ 21% بينما في الاصحاء بلغت نسبة الاليل T 83% بالمقارنة مع الاليل  17%   Cمع عدم وجود فروق معنوية. وقد تم التحقق من النتائج لبعض العينات بإيجاد التتابع النيوكليوتيدي إذ كانت النتائج متطابقة في التقنيتين لهذا الجين.

بينت نتائج الدراسة الحالية أن الطراز الجيني   AAللجين  SOD1له  دوراً فعالاً في حدوث الإلتهابات المعوية فقد كانت قيمة العامل المسبب للمرضEtiological Fraction (EF)    0.362 وقيمة الأرجحية   1.095  Odd Ratio (OR), أما الطراز الجيني المتغايرAC فإنه قد يلعب دوراً وقائياً لمنع حدوث الإلتهابات المعوية إذ كانت قيمة , OR -1.095)  , (PF – 0.176    كما سجل  Protective Fraction(PF) للطراز الجيني المتماثل CC 0.116. إن الأليل A ربما يزيد من قابلية الإستعداد الوراثي للمرض بينما الأليل C له دور في الحماية ضد الإلتهابات المعوية ,كما أشارت الى نتائج مماثلة في مرضى تقرح القولون وداء كرونز, كما أشارت الدراسة الحالية بأن الطراز الجيني TT لجين  TNF-α له دور واضح في نشوء الإلتهابات المعوية إذ أظهرت قيمة الأرجحية  OR 0.377 والعامل المسبب للمرض EF   بقيمة 0.511 وعلى العكس من ذلك فقد تبين أن الطرز الجينية CC,TC في هذه الدراسة تمتلك دوراً وقائياً لظهور قيمة (PF) 0.376 0.152, لكل منها على التوالي مع إنخفاض نسبة الأرجحية 0.352 0.0162, مع إحتمالية أن الأليل C ربما يمتلك دور وقائي بينما الأليل T قد يزيد من نسبة الإستعداد للإصابة بالإلتهابات المعوية.

واخيراً يستنتج من هذه الدراسة إن نسبة الإصابة بإلتهابات الأمعاء التقرحية أعلى من نسبة الإصابة بداء كرونز مع وجود فروق معنوية عالية (p>0.01 )  بنسبة الاصابة بالـIBD  في الاعمار الصغيرة والنساء بينت النتائج نسبة عالية من الأليل TT لجين  TNF-α في مرضى IBD   بنوعيه (التهاب القولون التقرحي وداء كرونز) مقارنة بالأنماط الجينية CC وTC مع عدم ظهور فروقات معنوية فضلاً عن وجود إرتباط معنوي بين الطرز الوراثية TT,TC  وعامل الجنس والعمرP<0.05  , وأشارت الى وجود نسبة عالية للأليل المتماثل AA للجين المشفر لأنزيم SOD مقارنة بالأليل غير المتماثل AC مع وجود فروقات معنوية (P=0. 0093) فضلاً عن وجود إرتباط معنوي بين الطرز الوراثية AA,AC  وعامل الجنس مع ظهور فروقات معنوية وعدم ظهور فروقات معنوية مع عامل العمر.

وفي ختام الرسالة اوصت الطالبة بالتوصيات الاتية :

-1 التحري عن التغايرات الوراثية في مناطق اخرى من جين, SOD1 SOD2 للتعرف على دورها المضاد للاكسدة وعلاقتها بالاستعداد الوراثي للاصابة بالتهابات الامعاء وتطورها الى اورام القولون والمستقيم .

-2 التحري عن التغايرات الوراثية في مناطق اخرى من محفزالجين TNF-α  لما لها من دور كبير في نشوء المرض وتطوره الى اورام خبيثة مثل -863, -857, -308 and -238   باستعمال بوادئ متخصصة.

-3 الكشف عن التغايرات الجينية لانزيمات Catalase (CAT)  Glutathione Peroxidase (GPX1),  المضادة للاكسدة مع التحري عن التعبير الجيني لها وامكانية استعمالها كمعلمات بايولوجية للكشف عن الاورام الخبيثة.

---

Genetic polymorphisms of super oxide dismutase and tumor necrosis-factor in Iraqi patients with inflammatory bowel disease IBD

By Inas Hussein Khamees

Supervised by Asst.prof.Wafaa Sabri Mahood

-Current study aimed to investigate genetic polymorphisms inSOD1and TNF-α genes in some Iraqi patients with IBD because of its  great importance in the occurrence of this disease and its association with occurrence of tumors and cancers in gastrointestinal tract GIT

Abstract :Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a chronic ,multifactorial disease which include two major types :ulcerative colitis( UC) which infects the colon in large intestine and crohn’s disease (CD) which can affects any part of the digestive tract from the mouth to anus ,Although the causes of the disease did not identified exactly but the researches proved that genetic environmental factors leading to an abnormal immune response for mucous layer of the bowel (mucosa) towards antigens with in the intestinal Lumen. Current study aimed to investigate genetic polymorphisms inSOD1and TNF-α genes in some Iraqi patients with IBD because of its  great importance in the occurrence of this disease and its association with occurrence of tumors and cancers in gastrointestinal tract (GIT).This study included collection of blood samples from the patients who attending gastrointestinal and liver disease in the city medicine from September to December .Genetic polymorphisms were investigated for each SOD1 and TNF-α genes by Restriction Fragment Length Polymorphisms(RFLP) and Sequencing. Current study include 75 samples from IBD Iraqi patients after confirming the diagnosis of the disease by the specialist doctor ,and 20 samples took from healthy as a control group (HC) for comparison purposes, We kept samples in fridge until use .The results showed that there was a high significant depending on some clinical characteristics of patients ,The incidence rate was 43(57%),32(43%) for females and males respectively as well as The incidence rate of Ulcerative Colitis UC (62.7%) was high compared with Crohn’s disease CD(37.3%) with high significant. The results of gel electrophoresis of DNA fragments for SOD1 gene which amplified by PCR technique and cut by restriction enzyme Hhal for Homozygous A Genotype gave one fragment size (278bp) and the ratio of Homozygous A Genotype in IBD Patients (94.67%) compared with healthy group (75%)( p=0.0093,Chi=7.149**,OR=1.095) with significant. The results of gel electrophoresis of DNA fragments for SOD1gene for Heterozygous A>C Genotype showed different size of fragments(278,207,71bp)               Heterozygous A>C genotype ratio (5.33%) in IBD  patients lower than healthy group (HC) (25%) with significant(p=0.0093, Chi=7.149**, OR=1.095)the Homozygous C Genotype not appear in both patients and healthy group.The results of allele frequency for A allele in IBD patients and healthy group respectively (97%,87.5%),and C allele in IBD patients and healthy group respectively (3%,12.5%). In addition, The results of gel electrophoresis on Agarose gel for DNA fractions for TNF-α  -1031 gene which amplified by PCR technique and cut by restriction enzyme BbSI :There are different size of DNA fragments for Homozygous T Genotype size(251,13bp) that indicate to existence different genotype for the TNF-α  -1031  gene ,the results showed that the Homozygous T Genotype in IBD patients (62.67%) compared with the control group (Healthy) (HC 70%)(p=0.061, ChI=3.091 NS, OR=0.377),The results of gel electrophoresis on Agarose gel for DNA fraction for TNF-α  -1031  for Homozygous C Genotype appear different size of DNA fragments(180,71bp) and the ratio of Homozygous C Genotype in IBD Patients (5.33%) compared with healthy group (5% )(p= 0.872, ChI=0.055 NS, OR=0.0162), The results of gel electrophoresis on Agarose gel for DNA fraction for The Heterozygous Genotype  T<C appear different size of DNA fragments(251,180,71bp), The Heterozygous Genotype  T<C ratio in IBD Patients(32%) compared with HC group(25%)( P=0.069, ChI= 2.983, OR=0.352).The results of allele frequency based on Hardey Weinberg showed very high ratio for T allele (79%) compared to C allele (21%) in patients while the results  in healthy group for T allele(83%) and C allele (17%) with non significant ,Current study revealed the active role of Homozygous A Genotype in the occurrence of the inflammations where the value of cause active agents was(EF=0.362,OR=1.095) while the Heterozygous Genotype A>C play protective role in block the incidence the value S (PF=0.176,OR=1.095) The value of PF for Heterozygous Genotype CC was 0.116 , As indicated for the active role of Homozygous T Genotype in emergence of inflammations the value of( EF=0.511,OR=0.377) on the contrary of that Homozygous C Genotype and Heterozygous Genotype T>C possess protective role against disease (PF=0.152,0.376) for CC and CT geno type respectively and the values of (OR=0.0162,0.376) for CC and CT genotype respectively  .In conclusion the results showed that the incidence of UC higher than CD and the incidence of IBD in ages less than 50 years higher than 50 or more years old .As well as in female more incidence than in male with high significant differences(p>0.01),As we found high percentage of homozygous allele AA for SOD1 gene compared with homozygous allele CC and heterozygous allele AC significant differences, and the high percentage of homozygous allele TT for TNF-α -1031 gene compared with homozygous allele CC and heterozygous allele TC with non significant                                       

:Recommendations

-Investigation of genetic polymorphisms in another region of SOD1,SOD2 gene to identify its antioxidant roles and its relationship to genetic predisposition to infection with IBD and colorectal cancer.

-Investigation of genetic polymorphisms in another site in promoter region ofTNF-αgene because of its great role in emergence of IBD and its development into malignant tumors like -863, -857, -308 and -238.

-Revealing of genetic polymorphisms for another antioxidant enzymes like :Catalase,Glutathion Peroxidase and the possibility of using them as biological parameters to detect malignant tumors.