قسم علوم الحياة يناقش رسالة ماجستير تبحث في تأثير بعض مثبطات الغشاء الحيوي لبكتيريا Proteus mirabilis المعزولة من الحروق و الجروح

Print Friendly, PDF & Email

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة (دراسة تأثير بعض مثبطات الغشاء الحيوي لبكتيريا Proteus mirabilis المعزولة من الحروق و الجروح ) للطالب ( أحمد وسام عزيز ) التي انجزها تحت اشراف التدريسية في القسم ( أ.م.د.  سعاد خليل إبراهيم ) ، ونوقشت من قبل لجنة المناقشة التي تألفت من الذوات المدرجة اسمائهم فيما يأتي :

  • أ.د. محمد فرج شذر (رئيسا)

  • أ.د. رنا مجاهد عبد الله (عضوا)

  • أ.م.د. نادرة سلمان محمد (عضوا)

  • أ.م.د. سعاد خليل إبراهيم (عضوا و مشرفا)

وتهدف الرسالة الى :

  1. جمع عزلات بكتيريا P.mirabilis من مصادر السريرية (الحروق و الجروح) و تشخيصها بالاعتماد على الصفات المجهرية و المزرعية و الكيموحيوية.

  2. تأكيد تشخيص العزلات البكتيرية باستعمال جهاز Vitek-2 Compact System و التشخيص الجزيئي بوساطة الجين SrRNA 16.

  3. التحري عن حساسية العزلات البكتيرية لمجاميع مختلفة للمضادات الحياتية. 

  4. الكشف المظهري و الجزيئي عن بعض عوامل الضراوة بكتيريا P.mirabilis.

  5. الكشف المظهري عن قابلية عزلات بكتيريا P.mirabilis على انتاج اغشاء الحيوي Biofilm و بطريقة الصفيحة العيارية الدقيقة.

  6. دراســــة تــأثــيــــر المسـتــخــلـــــص الـمــائــــي و الكـحــولـي و الـزيـــت الـطــيـــــار لنـبــات النـعـنــــــاع              Mentha sepacia ، المركب الطبيعي Menthol و جسيمات الفضة النانوية (AgNPs)     على النمو البكتيري و انتاج الغشاء الحيوي Biofilm.

  7. الكشف الجزيئي عن بعض الجينات (Ure C، Mrp A، pmr I) و التي لها علاقة بتكوين الغشاء الحيوي Biofilm.

  8. دراسة التسلسل التتابعي Sequencing لـ DNA الجينين (Mrp A، pmr I ).

و شملت الدراسة جمع 200 عينة تعود الى الجنس Proteus من إصابات الحروق و الجروح تضمنت (125) عينة من الحروق و (75) عينة من الجروح و من عـدة مستشفيات في مدينـة بغـداد هي: مستشفى الكـندي التعليمي ، مجمع مستشفيات مدينة الطب (مستشفى الحروق التخصصي ، مستشفى غازي الحريري التعليمي ، مستشفى بغداد التعليمي ، مستشفى الطفل المركزي  و المختبرات التعليمية ) ، للمـدة من 1/12/2018 الى 1/3/2019 . شخصت جميع العزلات اعتماداً على صفاتها المظهرية و الاختبارات الكيموحيوية ، و تم الحصول على 31 عزلة تعود لبكتريا Proteus mirabilis بعد ان تم تأكيدها باستعمال نظام Vitek 2 Compact System و البادئ النوعي للجين 16S rRNA باستعمال تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل PCR  إذ أظهرت نتائج التشخيص الجزيئي ان جميع العزلات البكتيرية امتلك الجين 16S rRNA .

بينت نتائج فحص حساسية عزلات P.mirabilis (31عزلة) للمضادات الحيوية بطريقة انتشار                   القرص Kirby-Bauer Method انها تمتلك المقاومة المتعددة لــ (2-12) من المضادات الحيوية المختبرة،                  إذ وجد ان اقل معدل مقاومة لعـــــزلات بكتيريا P.mirabilis كان لمضادات Norfloxacin (9.6%) يليه مضاد  Levofloxacin (13%) ،  Imipenem (16.1%) ، Ciprofloxacin (32.2%)  و Cefoxitin (38.7%) بينت نتائج الكشف المظهري عن عوامل ضراوة بكتيريا P.mirabilis إذ انها انتجت كلاً من انزيم اليوريز و الهيمولايسين و الجيلاتينيز بنسبة (100%) و البروتيز (77.5%) اما بالنسبة أنزيم الدنايز فقد انتجته بنسبة (93.5%) و المركبات الحاملة للحديد كانت بنسبة (16%).

     أظهرت طريقة الصفيحة العيارية الدقيقة Microtiter Plate ان جميع العزلات (100%) كونت الغشاء الحيوي و بدرجات مختلفة تم دراســــــــــة خصـائــــص الفـــــــضـة النــانــــويـــــــــة Silver Nanoparticles للتأكد من حــجـــــم جزيئاتها بالاعتماد على أجهزة التشخيص الرئيسية المتمثلة بجهاز حيود الاشعة السينية X-Ray Diffraction و الـــمـــــــــــجـــــهــــــــــــــــر الالكـــــتـــرونـــــــــــــــي الـمــاســــــــح ذو الانبـــعــاث الكــامـــل Scanning Electron Microscopy Field Emission  و مجهر القــوى الذرية Atomic Force Microscopy (AFM) اشارت النتائج ان المادة المفحوصة هي جزيئات الفضة النانوية (AgNPs) بصورة نقية و بأشكال مختلفة و احجام تتراوح بين 18-41 نانوميتر. درس تأثير المستخلص المائي و الكحولي لنبات النعناع Mentha sepacia و المركب الطبيعي  للنعناع Menthol و جسيمات الفضة النانوية (AgNPs) للعزلات المنتخبة (اربع عزلات)  الأكثر مقاومة للمضادات الحيوية و الشديدة التكوين للغشاء الحيوي على تثبيط النمو البكتيري و تثبيط الغشاء الحيوي Biofilm ، إذ بينت النتائج عدم تأثير المستخلص المائي و الكحولي لنبات النعناع في تثبيط النمو البكتيري و الغشاء الحيوي Biofilm في حين أظهرت ان الزيت الطيار لنبات Mentha sepacia  و المركب الطبيعي Menthol و جسيمات الفضة النانوية (AgNPs) كانت فعالة جداً في تثبيط النمو البكتيري و تثبيط الغشاء الحيوي Biofilm و بنسب مختلفة تبعاً الى مصدر العزلة وتركيز المادة. أظهرت نتائج الفحص الجزيئي للجينات (pmr I , mrp A ,Ure C ) المسؤولة او التي لها دور في تكوين الغشاء الحيوي Biofilm Formation ان عزلات بكتيريا P.mirabilis امتلكتها بنسبة ( 93.5% , 42% ، 90.3%) على التوالي أظهرت نتائج التحليل التتابعي DNA sequencing للبوادئ الامامية Forward   و العكسية  Reverse  للجـينــات (pmr I , mrp A) للعزلات الثلاثة المنتخبة ، إذ كانت نتائج التحليل التتابعي متطابقة للجين mrp A لجميع العزلات المنتخبة مقارنةً بالسلالات المرجعية بينما بالنسبة الجين pmr I فقد أظهرت النتائج وجود طفرتين من النوع الصامتة Silent Mutation.

    وخلص الطالب في ختام رسالته الى التوصيات الاتية :

  • اجراء دراسات لـقياس مستوى التعبير الجيني الناتج عن تأثير الزيت الطيار لنبات النعناع sepatia و المركب الطبيعي Menthol و جسيمات الفضة النانوية AgNPs .

  • اجراء دراسات حول الاليات التي تثبط او تحفز نمو بكتيريا mirabilis .

  • دراسة الية تشكل الغشاء الحيوي Biofilm و تثبيطه داخل جسم الكائن In Vivo .

  • اجراء دراسات مظهرية و جزيئية عن تأثير الزيت الطيار لنبات النعناع sepatia و المركب الطبيعي Menthol و جسيمات الفضة النانوية AgNPs على عوامل ضراوة بكتيريا P.mirabilis الاخرى مثل الهيمولايسين Hemolysin و انزيم اليوريز Urease و انزيم البروتيز Protease.

  • استعمال المضاد الحيوي Norfloxacin في علاج الإصابات الناتجة عن بكتيريا P.mirabilis المعزولة من الحروق و الجروح ، اذ أظهرت اقل معدل مقاومة (9.6%).


    Thesis title: study effect for some biofilm inhibitors in Proteus mirabilisBacteria isolated from Burns and Wounds

    By Amed.W.Aziz

    Supervised by Souad Khalil Ibrahim

    Aim of study

    -Collections of P.mirabilis isolates were collected from clinical sources (burns and wounds) and diagnosed based on microbiological characteristic, culture and biochemical characteristics   

    Confirmation of the diagnosis of bacterial isolates using the Vitek-2 Compact System and the molecular diagnosis by gene 16SrRNA

    – Investigate the sensitivity of bacterial isolates to different groups of antibiotics.

    – Phenotypic and molecular detection of some virulence factors for P.mirabilis.

    – Phenotypic detection of susceptibility to isolates of P.mirabilis bacteria on biofilm production by Microtiter plate method.

    – Study the effect of aqueous and alcoholic extracts and volatile oils of mint plant Mentha sepacia, natural compound Menthol and silver nanoparticles (AgNPs) on bacterial growth and biofilm production.

    -Molecular detection of some genes (Ure C, Mrp A, pmrI) that are related to Biofilm formation.

    – Study of Sequencing of the tow genes DNA (Mrp A, pmr I).

    Abstract

           The study included the collection of 200 specimens belonging to the genus Proteus from burns and wounds infection. It included (125) samples of burns and (75) samples of wounds and from several hospitals in Baghdad governorate: the Al-Kindy Teaching Hospital, the Medical City Hospital Complex (the Burns Specialist Hospital, Ghazi Al – Hariri Teaching Hospital, Baghdad Teaching Hospital, Central Child Hospital and Educational Laboratories), for the period from 1/12/2018 to 1/3/2019.         

          All isolates were diagnosed based on their phenotypic and biochemical tests, and (31 isolates) belonging to Proteus mirabilis were obtained after they were confirmed using the Vitek 2 Compact System and the 16S rRNA gene using the PCR technique, as the results of the molecular diagnosis showed that all Bacterial isolates possessed the 16S rRNA gene.                   

           The results of the of the sensitivity test of P.mirabilis isolates (31) isolates to the antibiotics using the Kirby-Bauer Method diffusion showed that they possessed the multiple resistance of (2-12) of the tested antibiotics, as it was found that the lowest rate of resistance to the isolates of P.mirabilis was to Norfloxacin ( 9.6%) is followed by Levofloxacin (13%), Imipenem, Ciprofloxacin (32.2%), and Cefoxitin(16.1%) .                                   (38.7%)

    The results of the phenotypic detection showed the virulence factors of P.mirabilis bacteria as they produced both urease enzyme, Hemolysin and Gelatinase by (100%) and Protease (77.5%). As for the enzyme DNase it produced at a rate (93.5%) and Siderophores compounds were at a rate (16%).                                                                                                                        

        As for the production of the biofilm, the method of culture in Congo Red agar (CRD) showed that 27 isolates (87%) formed the biofilm in different degrees, while the Microtiter plate (MTP) showed that all isolates (100%) formed the Biofilm and to varying degrees.                                                                     

         The characteristics of Silver Nanoparticles (AgNPs) have been studied to confirm the size of their particles by relying on the main diagnostic devices represented by the X-Ray Diffraction and the Electron-magnetic field (AFM) and Field Emission Scanning Electron Microscopy (FESEM). The results indicated that the examined material is pure silver nanoparticles (AgNPs) various forms and sizes ranging from 18-41 Nanometers.                                      

         Study the effect of the Aqueous and Alcoholic extract of the Mentha sepacia plant, the  Natural active compound of the Menthol mint and the silver nanoparticles (AgNPs) of the selected (4 isolates) that are more resistant to the antibiotic and highly-formed biofilm on the inhibition of bacterial growth and the inhibition of the biofilm, as the results showed The ineffectiveness of the aqueous and alcoholic extract of the mint plant on the inhibition of bacterial growth and the biofilm membrane, while it showed that the volatile oil of Mentha sepacia plant, Natural compound Menthol and silver nanoparticles (AgNPs) were very effective in inhibiting bacterial growth and inhibition of the Biofilm and in proportions different depending on the source of isolation and substance concentration                                           

         The results of molecular detection of genes (pmr I, mrp A, Ure C) responsible or having a role in the formation of Biofilm showed that     isolates of P.mirabilis bacteria possessed it by (90.3% ,42% ,90.3%) respectively.                                                                                                     

           The results of the DNA sequencing of the forward and Reverse genes of the genes (pmr I, mrp A) for the three selected isolates were shown, as the results of the analysis were identical to the pmr I gene for all the selected isolates compared to the reference strains while for the mrp A gene, the results showed that there is one mutation of the type Silent Mutation          

    Recommendation

    -Conducting studies to measure the level of gene expression resulting from the effect of the Volatile oil of the mint plant, M.spatcia, the natural compound Menthol and the silver nanoparticles (AgNPs    

    -Conducting studies on mechanisms that inhibit or stimulate the growth of P.mirabilis bacteria

    -study the mechanism of biofilm formation and inhibition inside the body of the object In Vivo

    – Conduct studies Molecular and phenotypic properties of the effect ofM. sepatcia, Menthol, and AgNPs on other virulence factors P.mirabilis bacteria such as Hemolysin, Urease and Protease.                                                                                                               

    -The use of the antibiotic Norfloxacin in treating infections caused by bacteria P.mirabilis isolated from burns and wounds, as it showed the lowest resistance rate (9.6%