قسم علوم الحياة يناقش اطروحة دكتوراة  تبحث في تأثير الاصابة  والعلاج الكيميائي لداء الاكياس المائية في الفئران

Print Friendly, PDF & Email

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة ( ابن الهيثم ) اطروحة الدكتوراة الموسومة ( تأثير الاصابة  والعلاج الكيميائي لداء الاكياس المائية في التعبير لبعض واسمات الموت الخلوي المبرمج في الفئران ) للطالب ( طالب وسين حسين حسن ) التي انجزها تحت اشراف التدريسية في القسم ( أ.م.د. وحيدة رشيد علي ) و ( أ.م.د. حيدر فيصل غازي ) و نوقشت من قبل لجنة المتاقشة التي تألفت من الاعضاء المدرجة أسمائهم في ما يأتي :

  • أ.د. سبأ طاهر محمد               ( رئيساً )

  • أ.د. فرحان عبود رسن             ( عضواً )

  • أ.م.د. حازمة موسى خليل      ( عضواً )

  • أ.م.د. زينب ثامر شويت           ( عضواً )   

  • أ.م.د. اسراء قاسم العبيدي    ( عضواً )

تـهدف الدراسة الحـالية الى :-

  1. اجراء الإصابة التجريبية بالاكياس المائية لذكور الفئران البيض سلالة Balb/c من خلال عزل الرؤيسات الأولية الحية من اكباد ورئات الأغنام المصابة طبيعياً وحقنها في الجوف الخلبي للفئران البيض.

  2. استعمال عقار الأوكسفيندازول بشكل مفرد او متحد مع عقار البرازيكونتل والالبندازول والمقارنة بينهما كمحاولة لعلاج الفئران البيض المصابة تجريبياً.

  3. تقييم بعض المعايير الدمية، الكيموحيوية والمناعية في امصال الفئران المصابة خلال مراحل نمو وتطور الاكياس المائية، وتحديد الكفاءة العلاجية للعقاقير المستعملة في الدراسة.

  4. دراسة نسجية مرضية لمعرفة التغير النسجي على مقاطع لكبد وطحال فئران التجربة.

  5. دراسة مناعية نسجية كيميائية من خلال الكشف عن مستوى التعبير النسجي لبعض بروتينات الموت الخلوي المبرمج وهي Bcl2 ، Bax ، Caspase 3 ،  PD-1ورابطه PD-L1 كعامل دلالة لعملية الموت الخلوي المبرمج في مقاطع الكبد والطحال، وتقدير تركيز معامل التنخر الخلوي-الفا  (TNF-α) وانترلوكين-4 (4 .(IL-

وتناولت هذه الدراسة جوانب اساسية للآلية الموت الخلوي المبرمج التي تعد من الخطوات المهمة في تحديد الدواء العلاجي، وعليه تم تسليط الضوء لتأثير الإصابة والعلاج لداء الاكياس المائية لعدد 90  فأراً من ذكور الفئران البيض سلالة Balb /c  بعمر 6-4 اسابيع، التي قسمت على ست مجاميع ( 15فأراً لكل مجموعة )، وحقنت المجاميع الخمس 2000±5 رؤيس اولي حيوي داخل التجويف الخلبي لها لاحداث الاصابة التجريبية بالاكياس المائية الثانوية، وتركت المجموعة السادسة كمجموعة تحكم سالبة. بعد مرور اربعة اشهر من الاصابة عولجت اربع مجاميع  لمدة شهرين متتالين بثلاثة عقاقيرمن مشتقات البنزيميدازول والايزوكوينولين هي (OXF 30 ملغم/كغم) (PZQ 40 ملغم/كغم) (ABZ 10 ملغم/كغم بشكل مفرد او مركب وكانت مجموعة OXF، OXF + PZQ،  OXF + ABZ و ABZ + PZQ .

تضمنت الدراسة جوانب عدة :-

الجانب الاول: متابعة  بعض الفحوصات الدمية المتمثلة بـصورة الدم والاختبارات المناعية كفرط الحساسية الآجل ومعامل البلعمة، سجلت مجاميع الفئران المعاملة بالعقاقير انخفاضاً بمعدل نسب  الخلايا الحمضة  واللمفية مع ارتفاع الخلايا العدلة وتباين نسب الخلايا احادية النواة مقارنة مع مجموعة التحكم الموجبة بعد الشهر الاول والثاني من العلاج. سجلت مجموعتا OXF وOXF+PZQ  انخفاضاً في العدد الكلي  لخلايا الدم البيض مقارنة مع مجموعة التحكم الموجبة والسالبة ، ارتفاع معنوي في كل من PCV و Hb للمجموعة المعاملة بعقار OXF مقارنة مع فئران مجموعة التحكم الموجبة. كما سجل OXF  اعلى زيادة معنوية في سمك وسادة القدم اليسرى قدره (0.77 ملم) بعد 24 ساعة مقارنة مع المجاميع الاخرى. اما معامل البلعمة فأن اعلى زيادة معنوية كانت في مجموعتي OXF+PZQ و OXF بنسب (69.36%( و(55.6%( على التوالي مقارنة مع المجاميع الاخرى.

الجانب الثاني: متابعة تاثير الاصابة والعلاجات الكيميائية قيد الدراسة في بعض الانزيمات والبروتينات العامة لوظائف الكبد كانزيم GPT، GOT وALP  فضلاً عن مستويات البروتين الكلي، الالبومين والكلوبيولين, وكانت النتائج  المجموعة المعاملة بـعقار OXF و  OXF+PZQ اقرب للسيطرة السالبة مقارنة مع  OXF+ABZ و ABZ+PZQ.

الجانب الثالث: تقييم المعايير التي اعتمدت وأخذت بالحسبان كمقياس لفاعلية العقاقير الثلاثة المستعملة، كانت اختزال أوزان الفئران وأوزان الكيس أو الأكياس المائية وأقطارها، والتغير الحاصل في شكل الكيس مظهرياً، ومعدلات أوزان الكبد والطحال ومعامل تضخمه، وحساب الكفاءة العلاجية النسبية، اذ وجد اعلى كفاءة علاجية كانت بمجموعة OXF+PZQ بنسبة 91.08% واقلها في مجموعة ABZ+PZQ بنسبة 79.60%.

الجانب الرابع: دراسة التغيرات النسجية المرضية في كبد وطحال الفئران المعاملة التي اشارت إلى أن العقاقير المستعملة قد أثرت في كل من الطبقة الصفائحية Laminated layer والطبقة الجرثومية Germinal layer من جدار الكيس المائي من خــلال إحداث تغيرات نسجية  طفيفة ومعتدلة مقارنة مع مجموعة التحكم الموجبة التي اظهرت تغيرات نسجية كبيرة نتيجة الاصابة بالاكياس المائية ادت الى فقدان  النمط التركيبي البنائي الطبيعي لها.

الجانب الخامس: دراسة تاثير الاصابة والعلاج الكيميائي لداء الاكياس المائية في التعبير عن بعض واسمات الموت الخلوي المبرمج لنسيج الكبد والطحال بطريقة تقانة الكيمونسجي المناعية (IHC), اذ سجل ارتفاع بتعبير بروتين Bax في أنسجة الكبد للمجاميع المعاملة OXF،  OXF+PZQ و   OXF +ABZ وانخفض في انسجة الطحال لمجموعةOXF  ومجموعة OXF + ABZ   و .ABZ + PZQ

بالرغم من التباين الطفيف في اختزال البروتين Bcl-2 بين المجموعات المعالجة  أظهرت مجموعة   OXF + ABZ أدنى تعبير لنسيج الكبد، بينما سجلت OXF + PZQ أقل مجموعة انخفاض بنسيج  الطحال وانخفض تعبير بروتين Caspase -3 أيضًا بعد شهرين من العلاج في المجاميع المعاملة مقارنة بالمجموعة غير المعالجة.  

اوضحت النتائج بقوة إلى أن استعادة العمليات الالتهابية بعد الحد من PD-1 / PD-L1 بعد العلاج اذ أظهرت النتائج أن هناك انخفاض احصائي كبير من تعبير PD-1 / PD-L1 في نسيج الكبد وطحال المجاميع  المعالجة من غير المعالجة. وعند التقصي في دور بعض الحركيات الخلوية في الاستجابة المناعية ضد الكيس المائي من خلال IHC، أظهر التحليل الاحصائي وجود فروق ذات دلالة احصائية عالية (p<0.001) في مستوى عامل تعبير عامل التنخر الورمي- الفا (TNF-α) والانترلوكين-4 (IL-4) بالمقارنة مع مجموعة التحكم الموجبة والسالبة، وسجلت الحركيات الخلوية انخفاضا في كل من أنسجة الكبد والطحال بالمجاميع العلاجية الاربع.

تعد هذه اول دراسة لوصف التعبير الخلوي لبعض واسمات الموت الخلوي المبرمج في كبد وطحال الفئران المصابة تجريبيا بالاكياس المائية الثانوية والمعالجة بعقاقير مختلفة لا سيما عقار OXF  وOXF + PZQ.


Effect of infection and chemotherapy of hydatidosis on expression of some apoptotic markers in mice

By TalibWaseen Hussein

Supervised by Asst.prof.Dr.Wahida .R.Ali and Haidar.F.Ghazi

Aims of the study

 Conducting experimental infection with Hydatid cyst of male white miceBalb / c strain by isolating live Protoscoleces from the livers and lungs of naturally infected sheep and injecting them into Intraperitonial of the white mice

. Using oxfendazole alone or in combination with praziquantel and Albendazole, and comparing them as an attempt to treat infected white mice experimentally

 Evaluation of some hematological, biochemical and immunological parameters in the sera of infected mice during the stages of growth and development of Hydatid cyst, and determining the therapeutic efficacy of the drugs used in the study

. A histopathological study to determine the histological change on sections of the liver and spleen of experiment mice

.A histochemical Immunohistochemical study by detecting the level of histological expression of some of the apoptosis proteins Bcl2, Bax, Caspase 3, PD-1 and its linkage PD-L1 as a sign of the cellular death process programmed in the liver and spleen sections, and estimating the Level of alpha-necrosis factor (TNF-α) and interleukin-4 .

The current research is deals with fundamental aspect of the mechanism programmed cell death, as it is one of the important steps in determining the therapeutic drug. Therefore, the effect of infection and treatment of hydatid cysts was highlighted to 90 white male mice Balb/ c strain at the age of 4-6 weeks and divided into six groups (15 mice per group) experimentally infection with secondary hydatid cyst through I/P   of 2000±5 viability protoscolices and left the sixth group as a negative control group.  Four months after infection four groups were treated for two months with three drugs which belong to benzimidazole  and isoquinolineviz Oxfendazole (OXF 30 mg/kg), Paraziquental (PZQ 40 mg/kg) and Albendazole (ABZ 10 mg /kg), drugs given to mice groups in single dose or mixed, as follows groups: OXF, OXF + PZQ, OXF + ABZ, and ABZ + PZQ.

The study included several aspects

First aspect: A study of some hematological and immunological parameters which included blood cell picture, delayed type hypersensitivity and index phagocytosis. Regarding   changes in differential white blood cell count, mice treated groups showed decreased percentages of eosinophil’s and lymphocytes with increased neutrophil cells and monocyte varied rate compared with positive control after the first and second month after treatment. The OXF and OXF + PZQ groups recorded a decrease in the total count of white blood cells compared to the positive and negative control group, while OXF showed an increase in both PCV and Hb also an increase in left foot pad thickness (0.77 mm) after 24 hours compared with other groups. As for the phagocytosis factor, the highest significant increase was in the OXF + PZQ and OXF groups with ratios of (69.36%) and (55.6%) respectively compared to other groups                                       

The second aspect of the study was to evaluate the effect of infection with hydatid cyst and different chemical treatment on liver functions where the study showed that liver enzymes such as GPT, GOT and ALP, as well as total protein, albumin and globulin serum level in mice treated with OXF alone and OXF + PZQ were closer to those of the negative group compared with the groups treated with OXF + ABZ and ABZ + PZQ.  

Third aspect: Evaluation of the criteria taken into consideration to determine the activity of the drugs used in this study were the reduction in weight and diameter of the cysts and the morphological changes occurred within the cysts weight and organ index of the liver and spleen   to calculated the relative therapeutic efficacy, as the highest treatment efficacy was found in the OXF + PZQ group at 91.08% and the lowest in the ABZ + PZQ group at 79.60%                                                                 

The fourth aspect of the study also included the evaluation of the pathological changes of liver and spleen of mice after treatment, the results indicated that the drugs used destroyed both the laminated  and germinal layers of the hydatid cysts wall through exerting changes in comparison with positive control group, Positive control mice that exhibited histological changes as a result of hydatid cysts led to a loss of their natural structure

The fifth aspect study   when investigating the role effect of infection and chemotherapy of hydatidosis on expression of some apoptotic markers in both liver and spleen through the Immunohistochemical (IHC) technique. Bax protein expression   was still elevated in liver tissue under treatment with OXF alone or in combination ABZ + PZQ, OXF + PZQ but it was reduced in spleen tissue under treatment with OXF in combination OXF + ABZ, ABZ + PZQ. Despite the little variation in the reduction of Bcl-2 protein among treated groups OXF+ABZ showed the lowest group in liver tissue while OXF+PZQ was recorded as lowest group of reduction in spleen tissue

Caspase -3 protein expression also reduced after two months of treatment in combination treatments in comparison with non-treated group. The results showed strongly suggesting that restoration of inflammatory processes after reduction of PD-1/PD-L1axis after treatment,  the results showed that there were statistical significant reduction of PD-1/PD-L1 expression in liver and  spleen treated  groups than those of none treated group   

The study also included the role of some cellular interleukins in the immune response against hydatid cyst through the IHC, the statistical analysis showed the presence of high significant differences (p< 0.001) in the level of expression protein Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and IL-4 in both liver and spleen tissue  in compared with negative and positive control groups , reduction level of cytokines TNF-α and IL-4 in mice treated with the four treated groups 

This is the first study to describe the cellular expression of some apoptotic markers in the liver and spleen of mice treated with different anthelminthic drugs regimens after experimental cystic

Echinococcosis infection, especially OXF and OXF + PZQ

Recommendation

. Use of the drug OXF + PZQ in other experiments on different   animals, and at different times of infection

. Conducting extensive studies on the effect of infection and    chemotherapy of OXF + PZQ on other proteins of Apotosis

. Conducting a study related to the genetic expression of Apoptosis proteins by using a polymerase chain reaction method (PCR), which helps in developing new strategies about the role of these proteins