ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة ( ابن الهيثم ) رسالة الماجستير الموسومة (التقييم المناعي والجزيئي لفعالية الخلايا اللمفاوية التائية المنظمة في مرضى عراقيين مصابين بداء المفاصل الرثوي او مرضى داء الصدفية ) للطالبة (: شوق رأفت محمد علي ) التي انجزتها تحت اشراف التدريسي في القسم ( أ.م.د. محمد مهدي جواد ) و التدريسية في جامعة الكرخ للعلوم ( أ.م.د. زينب ثامر شويت ) ونوقشت من قبل لجنة المتاقشة المدرج اسماء اعضائها فيما يأتي :
-
أ.م.د. حازمة موسى خليل ( رئيسا )
-
أ.م.د. محمد جواد خزعل (عضوا )
-
أ.م.د. سحر سعدي غريب ( عضوا )
-
أ.م.د. محمد مهدي جواد ( عضوا ومشرفا أول)
-
أ.م.د. زينب ثامر شويت ( عضوا ومشرفا ثاني)
وتهدف الرسالة الى :
-
تقدير مستوى الحركيات الخلوية (TGF-β1,IL-6) بواسطة تقنية الأمتزاز المناعي المرتبط بالأنزيم ELISA technique.
-
تقييم التعبير الجيني للجين LRRC32 (GARP) والتعبير الجيني لجين IKZF4 (EOS) بتقنية RT-qPCR..
-
أيجاد معامل الارتباط بين العوامل المدروسة لتقييم فعالية الخلايا اللمفاوية التائية المنظمة.
هدفت الدراسة الحالية الى تقييم فعالية الخلايا اللمفاوية التائية المنظمة T regulatory cells (Treg) في مرضى عراقيين مصابين بداء المفاصل الرثوي او مرضى مصابين بداء الصدفية من خلال قياس مستوى بعض الحركيات الخلوية (IL-6,TGF-β1) وقياس التعبير الجيني لجين Leucine rich repeat containing 32 (LRRC32 gene) (GARP) وجين Ikaros Zinc Finger 4 (IKZF4 gene) (EOS) .
تضمنت الدراسة الحالية 52 مريضا بين ذكور واناث تم تشخيص 30 مريضا بداء المفاصل الرثوي و 22 مريضا بداء الصدفية , تراوحت أعمارهم بين (72-18) عاما , تم جمع العينات من مستشفى بغداد التعليمي/مدينة الطب/ استشارية المفاصل , استشارية الجلدية/بغداد فضلا عن مجموعة الأصحاء والتي شملت (24) عينة, للفترة من( اب الى تشرين الثاني) 2019. مجموعة المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي قسمت الى 3 مجاميع ( المجموعة الأولى تضمنت 7 مرضى معالجين بالعلاج البايولوجي (Enbrel) Etanercept , المجموعة الثانية شملت 9 مرضى معالجين بالعلاج الكيمياوي MTX (Methotrexate) , المجموعة الثالثة شملت 14 مريضا معالجين بالعلاج البايوكيمياوي ) اما مرضى داء الصدفية قسمت الى مجموعتين ( المجموعة الأولى شملت 7 مرضى معالجين بالعلاج الموضعيvaseline,dermovate,betnosam,salicylic acid , المجموعة الثانية شملت 15 مريضا معالجين بالعلاج البايولوجي Etanercept ) فضلا عن مجموعة الأصحاء والتي شملت (24) عينة .تم قياس الحركيات الخلوية بواسطة تقنية الامتزاز المناعي المقترن بالأنزيم Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) بينما تم قياس مستويات التعبير الجيني لجينات LRRC32 و IKZF4 بواسطة تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل للنسخ العكسي
Reverse transcriptase – Quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).
أوضحت نتائج الدراسة الحالية وجود انخفاض معنوي(P ≤ 0.05) في مستوى TGF-β1 في مصل المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي والمعالجين بالعلاج البايولوجي مقارنة بالمرضى المعالجين بالعلاج الكيمياوي واخرين معالجين بعلاج بايوكيمياوي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة.حيث بلغ مستوى TGF-β1(0.26 ±0.05, 0.55±0.04, 0.51±0.06) بيكوغرام/مول على التوالي , بينما بلغ مستواه في مجموعة السيطرة (0.05±0.60) بيكوغرام/مول.
كذلك أوضحت الدراسة الحالية وجود انخفاض معنوي (P ≤ 0.05) في مستوى TGF-β1 في مصل المرضى المصابين بداء الصدفية والمعالجين بالعلاج الموضعي واخرين معالجين بالعلاج البايولوجي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة حيث كان مستوى TGF-β1 (0.31 ± 0.05, 0.40±0.06) بيكوغرام/مول على التوالي وكان مستواه في مجموعة السيطرة (0.05±0.60)بيكوغرام/مول .
أظهرت نتائج هذه الدراسة وجود ارتفاع معنوي(P ≤ 0.05) في مستوى IL-6 في المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي والمعالجين بالعلاج الكيمياوي والمعالجين بعلاج بايوكيمياوي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة حيث بلغ مستوى IL-6 (10.86±1.45, 12.03±1.97, 7.60±0.67) بيكوغرام/مول على التوالي , وكذلك بينت النتائج وجود اختلاف غير معنوي في المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي (2.98±11.14) بيكوغرام/مول بالمقارنة مع مجموعة السيطرة. في مرضى الصدفية , أوضحت النتائج وجود انخفاض غير معنوي في مستوى IL-6 للمرضى المعالجين بالعلاج الموضعي واخرين معالجين بالعلاج البايولوجي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة حيث بلغ مستوى 6IL- (9.25± 1.62, 7.17±0.63) بيكوغرام/مول على التوالي بينما بلغ مستواه في مجموعة السيطرة (7.60± 0.67) بيكوغرام/مول. أظهرت نتائج التعبير الجيني لجين LRRC32 ارتفاع معنوي في النسبة المئوية للتعبير الجيني (1851.9%) في المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100%. وفقا لنوع العلاج أظهرت النتائج ارتفاع معنوي في النسبة المئوية للتعبير الجيني لجين LRRC32 في المرضى تحت العلاج البايولوجي واخرين معالجين بعلاج بايوكيمياوي (2256.7%, 1939.4%) على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% , بينما هناك اختلافات غير معنوية في المرضى المعالجين بالعلاج الكيمياوي (1400.9%) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% وكذلك عدم وجود اختلافات معنوية بين المجاميع المرضية.
في مرضى الصدفية , أظهرت النتائج وجود ارتفاع في النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني لجين LRRC32 (1030.7%) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% ,وكذلك وجود ارتفاع معنوي في النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني لجين LRRC32 في المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي والمرضى المعالجين بالعلاج الموضعي(1192.3 %,682.6 % ) على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% . أوضحت نتائج قياس مستوى التعبير الجيني لجين IKZF4 (EOS) في المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي وجود ارتفاع معنوي في النسبة المئوية لجين IKZF4 (%992.1) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% , كذلك أوضحت النتائج وجود ارتفاع معنوي في النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني في المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي والمعالجين بالعلاج الكيمياوي والمعالجين بعلاج بايوكيمياوي (1382.3% ,998% ,794.1% ) على التوالي بالمقارنة مع مجموعة السيطرة.
بينما أوضحت النتائج وجود ارتفاع معنوي في النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني لجين IKZF4 في مرضى الصدفية (702.9%) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% , كذلك أوضحت النتائج وجود ارتفاع معنوي في النسبة المئوية لمستوى التعبير الجيني لجين IKZF4 في المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي (%747) بالمقارنة مع مجموعة السيطرة 100% , بينما كانت هناك اختلافات غير معنوية في المرضى المعالجين بالعلاج الموضعي (607.8 %) بالمقارنة مع المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي وكذلك مع مجموعة السيطرة.
أوضحت النتائج وجود عامل ارتباط عكسي معنوي (P ≤ 0.05) بين جينLRRC32 ومستوى TGF-β1 في المرضى المصابين بداء المفاصل الرثوي والمعالجين بالعلاج البايولوجي (r= -0.426). في الصدفية , أظهرت النتائج وجود عامل ارتباط عكسي معنوي (P ≤ 0.05) بين جينLRRC32 وTGF-β1 في المرضى المعالجين بالعلاج الموضعي(r= -0.446)* , وكذلك هناك عامل ارتباط موجب معنوي (P ≤ 0.05) بين جين IKZF4 وIL-6 في المرضى المعالجين بالعلاج الموضعي(r=0.445) وعامل ارتباط عكسي معنوي في المرضى المعالجين بالعلاج البايولوجي (r= -0.359).
وخلصت الباحثة الى التوصيات الاتية :
-
. توسيع الدراسات التي أشارت إلى دور ووظيفة الخلايا Treg في أمراض المناعة الذاتية من خلال دراسة مستقبلات أخرى وعوامل استنساخ اخرى تلعب دورًا في وظيفة هذه الخلايا ، سواء عن طريق تقنية PCR أو تقنيةFlow cytometry.
-
2. دراسة تعدد الأشكال الجينيgene polymorphism و تقنية الكيمياء النسيجية المناعية immunohistochemistry لكل من EOS و GARP لتحديد الجزء الذي يؤثر على فعالية الخلايا اللمفاوية التائية المنظمة Treg
-
3. اتباع استراتيجية علاجية جديدة تستهدف GARP و EOS للتحكم في وظيفة وفعالية خلايا Treg التي لها دور في العديد من الأمراض مثل أمراض المناعة الذاتية.
-
4. بسبب عدم المعنوية في بعض النتائج والتي قد يكون أحد أسبابها يعود الى محدودية حجم العينة ، لذلك من الضروري إجراء دراسات أو بحوث مكملة مع مراعاة حجم العينات.
-
5. استخدم الواسمات الوراثية genetic markersالأخرى التي قد تكون مناسبة لدراسة تسلسل الحمض النووي DNA sequencing ولأيجاد العلاقة بدراسات مرضية أخرى .
-
رفع هذا البحث إلى وزارة الصحة لإعتماد نتائج هذه الدراسة لاقتراح استراتيجيات علاجية مستقبلية.
Immunological and Molecular Investigation of Treg Activity in Rheumatoid Arthritis or Psoriasis Iraqi patients
By Shawq .Ra’afat Mohammed Ali
Supervised by Asst.prof.Dr.Mohammed Mahdi
Abstract
The current study aimed to determine the activity of regulatory T cells (Treg) in Iraqi patients with Rheumatoid Arthritis and patients with Psoriasis through evaluating the level of cytokines (TGF-β1, IL-6) and gene expression of Leucine rich repeat containing 32(LRRC32 gene)(GARP) andIkaros Zinc Finger 4(IKZF4 gene) (EOS).The present study included 52 patients (females and males), 30 patients diagnosed with Rheumatoid arthritis(RA) and 22 patients with psoriasis; their age ranged between (18-72) years, in Baghdad Teaching Hospital/Rheumatology consult, Dermatology consult/Medical City/Baghdad. The control group consists of 24 samples, over a period from (August to November) 2019. The RA patients divided into 3 groups: the first group consisted of 7 patients who treated with biological therapy anti-TNF (Etanercept); the second group consisted of 9 patients who treated with chemotherapy MTX (Methotrexate), and the last group consisted of 14 patients who treated with bio chemotherapy, while the Psoriasis patients included 2 groups, the first one consisted of 7 patients who treated with topical therapy (Salicylic acid, Betnosam, Dermovate and Vaseline) and the second group consisted of 15 patients who treated with biological therapy (Etanercept). The level of cytokines was measured by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniquewhile the gene expression level of LRRC32 gene and IKZF4 gene was measured by RT-qPCR technique
The results of our study showed a significant decreasing (P ≤ 0.05) in the level of TGF-β1 in the serum of RA patients thattreated with biological therapy compared to patients that treated with chemotherapy and others treated with bio chemotherapy, as well as to control group, the levels of TGF-β1 were (0.26±0.05,0.55±0.04,0.51±0.06) pg/ml respectively, while the level in control was (0.60±0.05) pg/ml
The results also showed there was a significant decreasing (P ≤ 0.05) in TGF-β1 serum level of Psoriasis patients that treated with topical therapy and others treated with biological therapy compared to the control group, where the TGF-β1 levels were (0.31±0.05,0.40±0.06) pg/ml respectively, while in control group was (0.60±0.05) pg/ml
The results of the current study showed a significant increasing in the level of IL-6 in patients with RA that treated with chemotherapy and those treated with bio chemotherapycompared to control group (10.86 ± 1.45, 12.03 ±1.97,7.60 ± 0.67) pg/ml respectively; alsothe results showed a non-significant differences in patients treated with biological therapy (11.14±2.98) pg/ml compared to control group (7.60 ± 0.67) pg/ml
In psoriasis patients, the results showed a non-significant differences in the level of IL-6 between patients groups (treated with topical therapy + treated with biological therapy) as compared with control;the IL-6 levels were (9.25± 1.62,7.17 ± 0.63) pg/ml respectively and its level in healthy group was (7.60 ±0.67) pg/ml.
The results of LRRC32 gene expression showed a higher significant percentage of the gene expression folding(1851.9%) in patients with RA whilethe percentage of control 100% . According to the type of therapy, the results showed a higher significant percentage of the gene expression folding of LRRC32 gene in the patients under biological therapy and others treated with bio chemotherapy (2256.7%, 1939.4%) respectively as compared to control percentage 100%, while there were a non-significant differences in patients treated with chemotherapy( 1400.9%) as compared to control percentage 100%.In psoriasis patients, the results showed a higher significant percentage of the gene expression folding of the LRRC32 gene (1030.7%) as compared to control percentage 100%,also there was a significant increasing in the percentage of the gene expression folding of LRRC32 gene in patients treated with biological therapy and in patients treated with topical therapy (1192.3%, 682.6%) respectively as compared to control percentage 100%.
The results of IKZF4 (EOS) gene expression level in RA patients illustrate a higher significant percentage of the gene expression foldingof IKZF4 gene (992.1%)as compared to control percentage 100%.Also, the results observed a significant increasing in the percentage of the IKZF4 (EOS) gene expression foldingin RA patients treated with biological therapy, chemotherapy, and patients treated with bio chemotherapy (1382.3%,998%,794.1%) respectively, as compared to control percentage 100% .
Where the results illustrate a higher significant percentage of the IKZF4 gene expression folding in patients with Psoriasis (702.9%) as compared to control percentage 100%. According to the type of therapy, there was a higher significant percentage of theIKZF4 gene expression folding in patients treated with biological therapy (747%) as compared to control percentage 100%,while there were a non-significant differences between patients treated with topical therapy(607.8%) and patients treated with biological therapy as well as to control group.
The results illustrated a significant negative coefficient correlation in this study (P ≤ 0.05) between the LRRC32 gene and TGF-β1 levels in patients with RA and treated with biological therapy (r= -0.426). In psoriasis the results showed a significant negative coefficient correlation in this study (P≤0.05) between LRRC32 gene and TGF-β1 in patients treated with topical therapy (r= -0.446), also there was a significant positive coefficient correlation (P ≤ 0.05) between IKZF4 gene and IL-6 in patients treated with topical therapy (r=0.445) and there was a significant negative coefficient correlation (P ≤ 0.05)in patients treated with biological therapy(r=-0.359).
