ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) ، اطروحة الدكتوراة الموسومة ( دراسة مايكروبية و جزيئية و مناعية للبكتيريا سالبة الكرام المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية و المعزولة من مرضى اللوكيميا الحادة العراقيين ) للطالب ( مصطفى سهيل مصطفى ) التي انجزها باشراف التدريسية في القسم ( ا.د. رنا مجاهد عبدالله ) ونوقشت من قبل لجنة المناقشة المبين اعضائها في ما يأتي :
- ا.د. واثق عباس حتيت – رئيسا
- ا.د. محمد فرج شذر – عضوا
- ا.د. رغد حربي مهدي – عضوا
- ا.د. حازمة موسى خليل – عضوا
- ا.م.د. سعاد خليل ابراهيم – عضوا
- ا.د. رنا مجاهد عبد الله – عضوا و مشرفا
هدفت هذه الدراسة الى التحري عن بعض انواع البكتيريا سالبة الكرام في مرضى اللوكيميا الحادة و التحري الجزيئي عن بعض المورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز واسعة الطيف و المورثات المشفرة للبورينات، اضافة الى تقييم مستويات بعض المؤشرات المناعية في هذه الفئة من المرضى.
مستخلص البحص:
ان الاخماج الناتجة عن البكتيريا سالبة الكرام عادة تسجل معدلات عالية في مرضى اللوكيميا الحادة (ابيضاض الدم الحاد) نتيجة لحالة النقص المناعي التي يعانون منها. هدفت هذه الدراسة الى التحري عن بعض انواع البكتيريا سالبة الكرام في مرضى اللوكيميا الحادة و التحري الجزيئي عن بعض المورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز واسعة الطيف و المورثات المشفرة للبورينات، اضافة الى تقييم مستويات بعض المؤشرات المناعية في هذه الفئة من المرضى.
تضمنت هذه الدراسة جمع 458 عينة سريرية من 260 مريض مصاب بأبيضاض الدم الحاد حيث تتراوح اعمارهم من 1 – 65 سنة و الراقدين في مركز امراض الدم/مدينة بغداد الطبية و مستشفى حماية الاطفال التعليمي و مستشفى الطفل المركزي التعليمي للفترة من كانون الثاني 2021 الى كانون الاول 2021. تم الحصول على 70 (15%) عزلة من البكتيريا سالبة الكرام بعد تشخيص جميع العينات بوساطة الاختبارات الكيموحيوية و بأستخدام جهاز الفايتك 2. شملت عزلات البكتيريا سالبة الكرام اربعة انواع توزعت كالتالي: Klebsiella pneumoniae 23 (33%) و Escherichia coli 21 (30%) و Pseudomonas aeruginosa 18 (26%) و Acinetobacter baumannii 8 (11%).
تم جمع اغلب هذه العزلات من الادرار 39 (55.71%) و من ثم من الدم 23 (32.85%) و بنسبة اقل من المسحات 8 (11.42%). تم الحصول على عزلات البكتيريا سالبة الكرام بشكل اعلى من مرضى ابيضاض الدم الحاد النخاعي 40 (57.14%) مقارنة بمرضى ابيضاض الدم الحاد الليمفاوي30 (42.85%).
تم اجراء فحص الحساسية تجاه اصناف مختلفة من المضادات الحيوية من خلال تحديد قيم التراكيز المثبطة الدنيا بأستخدام جهاز الفايتك 2. اظهرت النتائج ان نسبة كبيرة من عزلات بكتيريا K. pneumoniae و E. coli اظهرت مقاومة عالية لمضادات ticarcillin و piperacillin و ceftazidime و cefepime و من ثم بنسبة اقل لمضادات gentamicin و tobramycin و ciprofloxacin على التتالي. ان عزلات بكتيريا P. aeruginosa اظهرت مقاومة بسبة اقل من الجنسين السابقين للمضادات الحيوية. بشكل عام اظهر المضادات imipenem و meropenem و colistin فاعلية اكثر تجاه عزلات البكتيريا سالبة الكرام. من الملحوظ ان عزلات بكتيريا A. baumannii اظهرت مقاومة عالية تجاه جميع المضادات الحيوية مقارنة بانواع البكتيريا سالبة الكرام الاخرى.
تم انتاج انزيمات البيتالاكتيميز واسعة الطيف في 49 (70%) من عزلات البكتيريا سالبة الكرام تضمنت 18 (85.71%) عزلة من بكتيريا E. coli و 17 (94.44%) عزلة من بكتيريا P. aeruginosa و 11 (47.82%) عزلة من بكتيريا K. pneumoniae و 3 (37.5%) عزلة من بكتيريا A. baumannii. تم تشخيص نمط المقاومة المتعددة في 61 (87.14%) عزلة من البكتيريا سالبة الكرام حيث شملت جميع عزلات النوع K. pneumoniae 23 (100%) و النوع A. baumannii 8 (100%) بينما اظهرت عزلات كلا النوعين E. coli و P. aeruginosa نمط المقاومة المتعددة بنسبة 18 (85%) و 12 (66%) على التتالي. اضافة لذلك تم تشخيص العزلات المنتجة لانزيمات البيتالاكتميز واسعة الطيف في 40 (65.57%) من عزلات البكتيريا سالبة الكرام متعددة المقاومة للمضادات الحيوية حيث تضمنت 15 (83.33%) عزلة من بكتيريا E. coli و 11 (47.82%) عزلة من بكتيريا K. pneumoniae و 11 (91.66%) عزلة من بكتيريا P. aeruginosa و 3 (37.5%) عزلة من بكتيريا A. baumannii.
انتجت تقنية التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الاشكال (RAPD) انماطا وراثية مختلفة ضمن عزلات البكتيريا سالبة الكرام بلغت 14 و 12و 11 و 9 نمط وراثي في عزلات بكتيريا P. aeruginosa و E. coli و K. pneumoniae و A. baumannii على التتالي.
اظهر التشخيص الجزيئي للمورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز بأستخدام تقنية تفاعل البوليميريز التسلسلي (PCR) ان المورثات blaSHV و blaTEM و blaOXA و blaVIM و blaCMY-2 و blaSPM في 20 (28.57%) و 32 (45.71%) و 17 (24.28%) و 11 (15.71%) و 4 (5.71%) و 1 (1.42%) من عزلات البكتيريا سالبة الكرام. من جهة اخرى لم يتم تشخيص كل من المورثات blaCTX-M و blaIMP و blaNDM و blaKPC في العزلات البكتيرية المدروسة.
اظهر التشخيص الجزيئي للمورثات المشفرة للبورينات ان كلا المورثتين Omp36 و Omp37تم تشخيصهما في 20 (86.95%) و 11 (47.82%) من عزلات K. pneumoniaeعلى التتالي بينما لم يتم تشخيص المورثة Omp35 في هذه العزلات. بالاضافة لذلك تم تشخيص التواجد المشترك لكلا المورثتين Omp36 و Omp37في 11 (47.82%) من عزلات K. pneumoniae. تم تحديد كل من المورثات OmpA و OmpF و OmpC في 20 (95.23%) من عزلات E. coli. نتيجة لذلك فأن التواجد المشترك لهذه الجينات تم تشخيصه في 20 (95.23%) من عزلات E. coli. تم تشخيص المورثة 2OprD في 11 (61.11%) من عزلات P. aeruginosa. اضافة لذلك تم تشخيص المورثتين Omp33-36 و OprD في 7 (87.5%) من عزلات A. baumannii بينما تم تشخيص المورثة CarOفي 5 (62.5%) من عزلات نفس النوع. تم تشخيص التواجد المشترك للمورثات Omp33-36 و OprD و CarOفي 5 (62.5%) من عزلات A. baumannii.
اظهر تحليل تتابعات الحمض النووي DNA للمورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز و البورينات وجود بعض الطفرات الصامتة او الانحشارية و التي من الممكن ان تكون سببا في زيادة معدلات المقاومة للعزلات المدروسة تجاه المضادات الحيوية و بالتالي تطور نمط المقاومة المتعددة MDR المرتبط بالاخماج البكتيرية الخطرة. ان التحليل الوراثي النشوئي للتتابعات الوراثية الطافرة اسهم في دراسة المسارات الوبائية المحتملة للعزلات الكتيرية المرضية من خلال دوره في تحديد اصل العائل و مصدر العزل و الاصل المحتمل للعزلات المرضية المدروسة مع العزلات القريبة منها من اجل السيطرة و منع مسارات الاخماج البكتيرية المستشفوية و تلك المرتبطة بالاخماج العامة للبكتيريا سالبة الكرام خصوصا تلك المرتبطة بحالات النقص المناعي لمرضى ابيضاض الدم الحاد. تم تسجيل 132 رقم تسلسلي للعزلات البكتيرية الطافرة في المركز الوطني للتقانة الاحيائية.
تم تقييم الفعالية ضد المايكروبية لاثنين من مركبات الفلافونيدات و هما الكالنجين و الكيورستين تجاه ثمانية عزلات بكتيرية سالبة الكرام من خلال تحديد التراكيز المثبطة الدنيا (MICs)بأستخدام طريقة التخافيف المتسلسلة. تم تحديد التراكيز دون التراكيز المثبطة الدنيا (sub-MICs) للفلافونيدات المدروسة و ذلك لعزلتين من كل نوع بكتيري من البكتيريا سالبة الكرام و من ثم تم استخدام هذه التراكيز لتقييم تأثيرها ضد البكتيري على مستويات التعبير الجيني بأستخدام تقنية تفاعل البوليميريز التسلسلي الكمي بالوقت اللحظي Real-Time quantitative PCR و ذلك بأستهداف اربعة من المورثات المشفرة للبورينات. شملت هذه المورثات OmpK36 لبكتيريا K. pneumoniae و OmpA لبكتيريا E. coli و OprD2 لبكتيريا P. aeruginosa و OprD لبكتيريا A. baumannii. اظهرت النتائج فعالية الكالنجين و الكيورستين في تثبيط التعبير الجيني للمورثات المستهدفة بأستثناء المورثOmpA لبكتيريا E. coli.
ان المؤشرات المناعية التي تم تقييمها في هذه الدراسة تضمنت بروتينات الطور الحاد (البروتين التفاعلي سي CRP و البروكالسيتونين PCT و البروتين المرتبط باللبيد متعدد السكريد LBP) و الحركيات الخلوية (البين ابيضاضي- β1 و البين ابيضاضي-6 و البين ابيضاضي-8 و الانترفيرون كاما و عامل التنخر الورمي الفا) و العوامل الجرثومية القاتلة (اوكسيد النتريك و الهايبوكلوريت). ان هذه المؤشرات تم تقييمها بأستخدام تقنية الممتز المناعي المرتبط بالانزيم بأستثناء الهايبوكلوريت فقد تم تقييمه بأستخدام الطريقة اللونية. بشكل عام سجلت هذه المؤشرات مستويات عالية في مرضى ابيضاض الدم الحاد مقارنة بالمجموعة الضابطة.
استنتجت هذه الدراسة ان التغايرات الوراثية في تتابعات DNA للمورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز واسعة الطيف و المورثات المشفرة للبورينات من الممكن ان تساهم في تطور نمط المقاومة المتعددة في البكتيريا سالبة الكرام و المعزولة من مرضى اللوكيميا الحادة. بالاضافة لذلك، اظهر الكالنجين و الكيورستين تأثيرهما ضد البكتيري بشكل فعال تجاه البكتيريا سالبة الكرام المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية. ان تقييم مستويات المؤشرات المناعية من الممكن ان يساعد في التنبؤ المبكر بالاصابة البكتيرية و يقلل من استخدام المضادات الحيوية و يحد من تطور نمط المقاومة المتعددة في البكتيريا سالبة الكرام خصوصا تلك المعزولة من مرضى اللوكيميا الحادة الذين يعانون من حالة النقص المناعي.
وخلص الطالب الى التوصيات الاتية:
- عزل البكتيريا موجبة الكرام و الفطريات و الفايروسات من مرضى اللوكيميا الحادة لمقارنة دورها المرضي في هذه المجموعة الخطيرة من المرضى ذوي النقص المناعي.
- استخدام طرائق تنميط جزيئي اكثر تعقيدا و خصوصا التنميط الرايبي و تنميط التتابع متعدد الموقع والترحيل الكهربائي للهلام بالحقل المظلم لتتبع مسارات انتشار السلالات الخطيرة من البكتيريا سالبة الكرام.
- التحري بشكل اكثر عن حدوث و تردد الطفرات في المورثات المشفرة لانزيمات البيتالاكتميز واسعة الطيف و المورثات المشفرة للبورينات و دورها المحتمل في تطور المقاومة البكتيرية للمضادات الحيوية من خلال تثبيط تعبير هذه المورثات او انبثاق مورثات جديدة للمقاومة البكتيرية.
- التركيز على الفعالية ضد البكتيرية لمركبات الفلافونويدات لاستهداف اخماج البكتيريا سالبة الكرام المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية المرتبطة بالاصابات الخطيرة و بشكل مفضل يتم اقرانها مع المضادات الحيوية و الدقائق النانوية.
- تقييم مستويات بوتينات الطور الحاد و خصوصا البروكالسيتونين و البروتين المرتبط باللبيد متعدد السكريد من الممكن ان يساعد في التنبؤ المبكر عن الاصابة البكتيرية للسيطرة على الاستخدام المتزايد و العشوائي للمضادات الحيوية و خصوصا في حالة الاصابات البكتيرية الخطيرة مثل تعفن الدم.
- تقييم مستويات الحركيات الخلوية من الممكن ان يطبق كعلاج مناعي واعد بالنسبة لمرضى اللوكيميا الحادة.
