ناقش قسم علوم الحياة اطروحة الدكتوراه الموسومة ( التحري عن تعبير جينات مضخات الدفق تحت تأثير بعض المضادات الحيوية في بكتريا Klebsiella pneumoniae المعزولة من عينات سريرية مختلفة ) للطالبة ( دعاء راشد حمادي ) التي انجزتها باشراف التدريسية في القسم ( أ.د. رنا مجاهد عبد الله ) ونوقشت من قبل اعضاء لجنة المناقشة المبينة اسمائهم في ما يأتي :
- أ.د. جبار سلمان حسان – رئيسا
- أ.د. اسماء صباح احميد عضوا
- أ.م.د. سعاد خلل ابراهيم – عضوا
- أ.م.د. وفاء صبري ماهود – عضوا
- أ.م.د. محمد عباس فياض – عضوا
- أ.د. رنا مجاهد عبد الله – عضوا و مشرفا
ويهدف البحث الى دراسة ثأثير المضادين Ceftazidime و Gentamycin وتأزرهما معا على التعبير الجيني لبعض جينات مضخات الدفق لبكتريا K.pneumoniae المعزولة من عينات سريرية مختلفة.
وحيث هذه الدراسة هدفت الى تحري عن بعض جينات مضخات الدفق في عدد من العزلات المرضية لبكتريا Klebsiella pneumoniae ودورها في مقاومة المضادات الحيوية.تم التحقق من وجود مضخات الدفق acrAB، tolC، mdtk، oqxA، oqxB بتقنية تفاعل البلمرة المتسلسل، وكذلك دراسة التعبير الجيني لهذه الجينات بتقنية RT-qPCR.
وتم جمع 130 عينة سريرية من المرضى الراقدين في عدة مستشفيات في مدينة بغداد شملت: (مستشفى الامامين الكاظمين (ع)، مستشفى الكرخ العام، مستشفى اطفال الكاظمية، مستشفى الحروق، مستشفى غازي الحريري ومستشفى بغداد) ،في الفترة من 15/10/2023 الى 25/12/2023. شملت عينات الدراسة (البول، القشع، الجروح، الدم والحروق) كانت أعلى نسبة عزل لبكتريا K.pneumoniaeمن عينات البول للمرضى المصابين بالتهابات المسالك البولية، اذ بلغت 25 عزلة بنسبة (50%)، 14 عزلة بنسبة (28%) من القشع، 6 عزلات بنسبة (12%) من الجروح، 3 عزلات بنسبة (6%) من الدم، عزلتين بنسبة (4%) من الحروق. وكان مجموع العزلات التي تم الحصول عليها من بكتريا K. pneumoniae هو 50 عزلة بكتيرية شكلت نسبة (38.4 %) من مجموع العزلات الاخرى.
تم تشخيص العزلات مظهريا بعد تنميتها على مجموعة من الاوساط الزرعية منها وسط الماكونكي الصلب، وسط الايوسين مثلين الازرق الصلب، وسط الدم الصلب، وسط الكروماجين الصلب ، فضلا عن الاختبارات المجهرية والاختبارات الكيموحيوية التي شملت اختبار الاوكسيديز ،اختبار الاندول ، اختبار الحركة ، اختبار الاحمر المثيل وللتشخيص النهائي استخدم التشخيص الجيني عن طريق الكشف عن جين .16S rRNA
اجريت دراسة اختبار الحساسية لعزلات بكتريا K. pneumoniae بأستخدام جهاز الفايتك لخمسة عشر مضادا حيويا شملت المضادات:Ticarcillin ، Ticarcillin/Clavulanic acid، Piperacillin، Piperacillin/Tazobactam، Ceftazidime، Cefepime، Aztreonam، Imipenem، Meropenem، Amikacin، Gentamicin، Tobramycin، Ciprofloxacin، Minocycline، Trimethoprim/ Sulfamethoxazole.
اظهرت جميع العزلات البكتيرية مقاومة لمضادي Ticarcillin و Piperacillin وبنسبة (100%)، ولمضاد Aztreonam بنسبة (88%)، وللمضاد Ticarcillin/Clavulanic acid وبنسبة (86%)، ولمضادي Ceftazidime و Trimethoprim/ Sulfamethoxazole بنسبة (78%)، ولمضادي Cefepime وCiprofloxacin بنسبة (68%)، ولمضاد Tobramycin بنسبة (66%)، ولمضادي Piperacillin/Tazobactam و Imipenem بنسبة (64%)، ومضاد Meropenem بنسبة (60%)، ومضاد Gentamicin بنسبة (56%)، ومضاد Amikacin بنسبة (40%)، واخيرا مضاد Minocyclineبنسبة (34%).
تم تحديد 12 نمطاً مختلفا من انماط المقاومة للمضادات المدروسة، ونمط المقاومة للمضادات المتعددةMDR الذي شكل نسبة 34(68%) من عزلات K.pneumoniae المدروسة. اما قابلية العزلات البكتيرية على تكوين الغشاء الحيوي فقد تم اختبارها باستخدام طريقة الصفيحة العيارية ، واظهرت النتائج قابلية العزلات على تكوين الاغشية الحيوية بنسبة عالية بلغت (100%) وبدرجات متفاوتة الشدة بالمقارنة بالسيطرة السالبة ، في حين كانت 31 عزلة بكتيرية بنسبة (62%) لها القابلية على التكوين القوي للغشاء الحيوي، و13 عزلة بكتيرية بنسبة (26%) لها القابلية على التكوين المتوسط للغشاء الحيوي، و6 عزلات بكتيرية بنسبة (12%) لها القابلية على التكوين الضعيف للغشاء الحيوي.
اظهرت نتائج الدراسة الحالية وجود الجينات acrAB، tolC، mdtk، oqxA، oqxB في البكتريا المدروسة بنسبة 100%، 100%، 70%، 100%، 54% على التتالي.
كانت نتائج التركيز المثبط دون الحد الادنى بطريقة الصفيحة العيارية لجميع العزلات المقاومة للمضادات الحيوية (11، 22، 25، 33، 41) لمضاد Gentamycin بلغت 25 ميكروغرام /مل، اما نتائج التركيز المثبط دون الحد الادنى للعزلات المقاومة للمضادات الحيوية لمضاد Ceftazidime بلغ 3.9 ميكروغرام /مل لاربع عزلات بكترية (22، 25، 33، 41) اما العزلة (11) فقد كان التركيز المثبط دون الحد الادنى 1.9 ميكروغرام /مل. اما العزلة الحساسة للمضادات الحيوية فقد استخدمت طريقة الانابيب وبلغ التركيز المثبط دون الحد الادنى 0.0156 ميكروغرام /مل للمضادينCeftazidime وGentamycin.
تم استعمال برنامج التحليل الاحصائي لايجاد متوسطات القيم والخطأ القياسي وايجاد العلاقة بين المتغيرات والارتباطات بين المعاملات والجينات. بينت نتائج الدراسة تأثير كل من المضادين Ceftazidime وGentamicin وتآزرهما معا على التعبيرعن جينات مضخات الدفق الخمسة acrAB، tolC، oqxA، oqxB، mdtk لخمسة عزلات من بكتريا K.pneumoniae، اذ كانت ذات مقاومة متعددة للمضادات الحيوية، وعزلة اخرى كانت حساسة للمضادات الحيوية المتعددة .اظهر التحليل الاحصائي بين معظم المعاملات المدروسة وجود فروق معنوية عالية بلغتp≤0.001.
اظهرت نتائج التعبير الجيني باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي للعزلات المقاومة ارتفاع في Gene folding في كل الجينات المعاملة بالمضاد الحيوي Ceftazidime في حين ارتفع Gene folding في الجينين tolC وmdtk بالنسبة بالمعاملة بالمضاد الحيوي Gentamicin ، اما الخليط التآزري من المضادين الحيويين Ceftazidime+Gentamicin فقد سجل الجين mdtk فقط ارتفاع في Gene folding. كما اظهرت النتائج ان هناك ارتباط عالي وسالب (ارتباط عكسي) بين الغالبية العظمى من الجينات ما عدا معاملة خليط المضادين الحيويين Ceftazidime+Gentamicin معا للجين mdtK، حيث كان الارتباط موجب لهذه المعاملة مع كل الجينات في معاملات العزلات المقاومة الثلاثة وكذلك كان هناك ارتباط عالي وسالب او موجب بين المعاملات الثلاثة وفقا لمعامل بيرسون للارتباط.
سجل Gene folding للعزلات الحساسة انخفاض معنوي في التعبير الجيني لمعظم العزلات المدروسة بلغ p≤0.001 مقارنة بمعاملة السيطرة، ما عدا الجين oqxA في معاملتي المضاد الحيوي Ceftazidime وخليط المضادين الحيويين Ceftazidime+Gentamicin، والجين tolC في معاملة خليط المضادين Ceftazidime+Gentamicin اذ سجلوا ارتفاع طفيف غير معنوي بلغ p>0.05 مقارنة بمعاملة السيطرة.
اما بالنسبة لمعامل الارتباط بين الجينات في المعاملات الثلاثة للعزلات الحساسة، فقد اظهرت نتائج وجود ارتباط وعلاقة عالية وسالبة (عكسي) بين كل الجينات في كل المعاملات، في حين كان هناك ارتباط عالي وموجب (طردي) بين معاملتي Ceftazidime للعزلات الحساسة وبين خليط المضادين الحيويين Ceftazidime+Gentamicin معا، في حين لم تظهر بقية المعاملات بالنسبة للعزلات الحساسة اي ارتباط لعدم تسجيلها اي وجود اي متغير فيها باستخدام معامل بيرسون للارتباط.
بينت نتائج التنميط الجيني لبكتريا K.pneumoniae باستعمال طريقة التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال، وجود 12 نمطا متميزة ذات أوزان جزيئية بين 250-1500 زوج قاعدة، وكانت الحزم الأكثر شيوعًا هي 500 و550 و1400 زوج قاعدة. ومع ذلك أظهرت 43 عزلة بنسبة (86٪) من العزلات تحتوي على حزم، فيما لم تظهر 7 عزلات بنسبة (14٪) وجود تلك الحزم.
.
وفي ختام الاطروحة خلصت الطالبة الى التوصيات الاتية:
1.اجراء المزيد من الدراسات عن الاليات الاخرى لمقاومة البكتريا للمضادات الحيوية وجيناتها في العزلات المحلية لبكتيريا K. pneumoniae.
2. اجراء دراسات متعددة على جينات الضراوة الاخرى وجينات المقاومه للمضادات الحيوية ودراسة تاثير الطفرات على الجينات ودورها في امراضية بكتريا K.pneumoniae.
3. دراسة مدى انتشار جينات مضخة الدفق الأخرى في العزلات المحلية لـ K.pneumoniae.
4. استخدام مواد مثبطة كمستخلصات النباتات الطبية والنانوية في تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي qPCR ومعرفة فعالية هذه المواد على بكتريا K. pneumoniae.
5. اجراء طرق التنميط الجيني الاخرى لبكتريا K. pneumoniae لتحديد العزلات الاكثر ضراوة ولفهم الارتباط الجيني وتحديد امراضيتها لمنع انتشارها
