جرت بعون الله تعالى مناقشة اطروحة الدكتوراه للطالبة نورهان خالد شفيق من قسم الكيمياء وذلك في يوم الثلاثاء الموافق 29 / 12 / 2015 وعلى قاعة المرحوم الاستاذ الدكتور فهد علي حسين الجبوري
وكان عنوان الأطروحة :
وتألفت لجنة المناقشة من الأساتذة :
أ.د. قسمة محمد تركي رئيساً
أ.د. نزار احمد ناجي عضواً
أ.م.د. منتهى عباس لفتة عضواً
أ.م.د. تغريد علوم محمد عضواً
أ.م.د. مصطفى طه محمد عضواً
أ.م.د. زينب منيب مالك عضواً ومشرفاً
أ.م.د طارق محمد رجب عضواً ومشرفاً
أ.م.د رباح نجاح جبار عضواً واستشارياً
كان هدف هذه الدراسة الى تنقية البروتين (GPCR) من الغشاء الخلوي و خلايا خميرة الخبزلعزله محليه من (Saccharomyces cerevisiae) بطرق كرموتوغرافية مختلفة و ذلك لامتيازها بسهولة الاستجابة للتغيرات الجينية و الاستقرارية الثابتة اضافة الى ذلك فان الاشارات الداخل و الخارج – خلوية لهذا البروتين (GPCR) في هذا النوع من الخلايا يستعمل كأداة مهمة لدراسة تركيب وظيفة هذا البروتين في هذا النوع من الخلايا الحقيقة النواة. تم تحديد الوزن الجزيئي للبروتين المنقّى من مصدرين من الغشاء الخلوي و خلايا الخميرة (Saccharomyces cerevisiae) التي اعطت دليلا على نقاوة الانزيم المستخلص . .
تم الحصول على العزلة من قسم البايولوجي / كلية العلوم / جامعة الموصل / و تم التأكد منها بإجراء الفحوصات الميكروسكوبية و البايوكيمياوية . و تم تنميتها و تنشيطها على وسط (وسط مستخلص الخميره ببتون دكستروز ) الصلب و اعادة تنشيطها كل اسبوعين و استخدمت المواد (الهستدين,داي مثيل سلفوكسايد) في وسط التنمية .
تم استخلاص (GPCR) من خلايا الخميرة بدارىء الفوسفات الحاوي على,(ن-دوديكايل-بيتا مالتوسايد) اضافه الى (مثبط بروتيازكوكتيل) بالموجات فوق الصوتية. اما الغشاء الخلوي فتمت اذابته
بدراي الفوسفات الحاوي على (ن-دوديكايل-بيتا مالتوسايد) اضافه الى (مثبط بروتيازكوكتيل)و استخلاص البروتين بالرج الدوراني باستخدام الحبيبات الزجاجيه وجهاز الطرد المركزي الفائق السرعه.
تمت تنقية ال (GPCR) المستخلص من خلايا الخميرة بخطوتين متعاقبتين . تضمنت اولاً خطوة كروموتوكرافيا التبادل الايوني باستخدام المبادل (دي إي أي إي-سيفاروز) و تم استرداد البروتين المرتبط باستخدام محلول ملحي متدرج من M (0.1-0.5) NaCl . و كخطوة ثانية تم استخدام بتقنية الترشيح الهلامي باستخدام هلام الفصل (سيفاروز-6بي) اما ال (GPCR) المستخلص من الغشاء الخلوي لل (S.cerevisiae) فتمت تنقيته بخطوتين . بتقنية الترشيح الهلامي باستخدام هلام الفصل (سيفاروز-6بي) و الدارئ فوسفيت بفر سلاين بدالة حامضيه (PH=7.4) . و تم تحديد الوزن الجزيئي لل (GPCR) المنقى بالترشيح الهلامي باستخدام بلو دكستران و باستخدام محاليل البروتينات قياسية معروفة الوزن الجزيئي لرسم العلاقه بين لوغاريتم الوزن الجزيئي لهذه البروتينات و النسبة بين (Ve/Vo) .
تم تحديد نقاوة البروتين المستخلص من خلايا الغشاء الخلوي لخميرة الخبز (S. cerevisiae) باستخدام هلام الاكريلمايد باجراء الترحيل الكهربائي تحت ظروف ماسخه للبروتين تمت دراسة الصفات الميكروسكوبية و المورفولوجية للعزلة المحلية (S. cerevisiae) على وسط التنمية (وسط مستخلص الخميره ببتون دكستروز) فظهرت المستعمرات سميكة كريمية اللون دائرية الشكل و بحجم (1-2) ملم اما تحت المجهر فظهرت بشكل دائري او بيضوي متجمغة مثل خلية النحل و تحتوي على نواة حقيقة كبيرة و اعطت نتائج ايجابية مع استهلاك و تخمر السكريات الاولية و الثانوية و الثالثية ما عدا اللاكتوز التي اعطت نتيجة سلبية و كذلك اعطت نتيجة سلبية مع تحليل اليوريا.
كما اظهرت نتائج تنقيه البروتين المستخلص من الخلايا قمتين للبروتين عند استرداده بالمحلول الملحي المتدرج بينما لم تظهر اي قمة للبروتين في اجزاء الغسل و قد اقتصر وجود (GPCR) في القمة الاولى للبروتين عند التركيز (M 0.1 لل NaCl ) في الاجزاء من (3-9) ركزت هذه الاجزاء بالسكروز و امررت من عمود الترشيح الهلامي سيفاروس -6بي التي اعطت قمة واحدة فعالة لل (GPCR) للاجزاء (24-35). .
اما (GPCR) المستخلص من الغشاء الخلوي فتمت تنقيته بتقنية الترشيح الهلامي بخطوتين ففي الخطوة الاولى ظهرت قمم متعدة للبروتين باستخدام دارئ الاسترداد ، فقط قمة واحدة اعطت فعالية لل (GPCR) جمعت الاجزاء و ركزت بالسكروز و امررت للمرة الثانية على عمود الترشيح الهلامي (96*1.6) سم تحت نفس الظروف و قد اعطت هذه الخطوة قمة واحدة للبروتين اعطت فعالية لل (GPCR) الوزن الجزيئي لل (GPCR) تم تحديدها بطريقة الترشيح الهلامي و كانت بحدود (~32.359KD )كيلو دالتون لل (GPCR) المستخلص من خلايا الخميرة و (~54.954) كيلو دالتون لل (GPCR) المستخلص من الغشاء الخلوي .
و تم التأكد من نقاوة البروتين المعزول بأجراء الترحيل الكهربائي بوجود المواد الماسخة للبروتين (SDS-PAGE) حين اعطت حزمة مفردة مع اوزان جزيئيه KD)33~) و(~55KD)على التوالي لل (GPCR) المستخلص من الغشاء الخلوي و خلايا الخميرة (S. cerevisiae)
هذا وحضر المناقشة جمع من اساتذة الكلية والقسم الى جانب عدد من طلبة الدراسات العليا متمنين للباحثة دوام الموفقية ومزيدا من الانجازات العلمية مستقبلاً .
