أطروحة دكتوراه تبحث التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بوساطة ACinetobacter baumannii وتقييم أنشطتها المضادة للبكتيريا والسرطان

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة – ابن الهيثم أطروحة الدكتوراه الموسومة (  التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بوساطة ACinetobacter baumannii وتقييم أنشطتها المضادة للبكتيريا والسرطان )  للطالبة ( انتصار حميد علي )  التي اجزتها باشراف التدريسي في القسم ( أ.م.د. عصام جاسم خريبط ) ونوقشت من قبل أعضاء لجنة المناقشة المبينة أسمائهم في ما يأتي :

– أ.د. ماجد صخي جابر – رئيسا

– ا.د. هنادي سالم عبد الصاحب – عضوا

– ا.م.د. هند حسين عبيد – عضوا

– أ.م.د. ليث احمد يعقوب – عضوا

– ا.م .د سعاد خليل ابراهيم – عضوا

– ا.م.د عصام جاسم خريبط – عضوا و مشرفا

ويهدف البحث الى استغلال الوسط الزرعي للبكتريا  لأكثر البكتيريا شيوعًا في الجروح والحروق في تصنيع جسيمات الذهب النانوية وتقييم الأنشطة البيولوجية لجسيمات الذهب النانوية المصنوعة حيوياً.

وتم في هذه الدراسة عزل وتشخيص البكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية والتي تنتج غشاءا حيويأ والمعزولة من المرضى المصابين بالجروح والحروق، ومن ثم التركيب الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بالطرق الخضراء باستخدام وسط الزرعي للمرق المغذي لبكتريا Acinetobacter baumannii  ودراسة  تاثيره المضاد للبكتريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية  والمضاد لتكوين الغشاء الحيوي وايضا نشاطه المضاد للسرطان كبديل محتمل للعلاجات التقليدية.

تم جمع150  عينة من إصابات الحروق والجروح من مرضى عراقيين تم إدخالهم إلى مستشفيات مدينة بغداد (مستشفيات المدينة الطبية، ومستشفى اليرموك التعليمي، ومستشفى الكندي التعليمي)، للفترة من   1/12/2021 to 30/3/ 2022.

تم التعرف على العزلات البكتيرية مبدئيًا باستخدام وسط زرعي انتقائي ومن ثم  الفحص المجهري والاختبارات الكيموحيوية واستخدام كت تشخيص البكتريا الذي يعرف ب DIAGNOSTICS s.r.o. ومن ثم التشخيص التأكيدي لهذه العزلات تم بواسطة جهازالفايتك  Vitek- 2Compact System.

تم تشخيص ثلاثة أنواع من البكتيريا موجبة الجرام وهي:Staphylococcus aureus و Staphylococcus epidermidis و Enterococcus spp. والتي تم عزلها من الجروح بنسبة  10 (45.4%) , 9 (59.5%) , 1 (25%).  في المقابل، تم عزلهم من الحروق بنسبة 12 (54.5%), 8 (59.5%), , 3(75%)، هناك سبعة أنواع تنتمي إلى بكتريا سالبة الجرام النشطة، وهي Acinetobacte baumannii، وPseudomonas aeruginosa، وEscherichia coli، وKlebsiella pneumoniae، وProteus mirabilis، و Burkholderia cepacian، وMorganella morgani التي تم عزلها من الجروح 18(69.2%), 14(70%), 9 (60%), 3 (30%) ,2 (33.3%) (100%) , 1(100%),  على التوالي، بالمقابل تم عزلهم من الحروق بنسبة 8 (30.7%), 6(30. %), 6(40. %), 7 (70%), 4(66.6%), 0%,  على التوالي.

تم الحصول على 123 عزلة نقية فقط بعد الزراعة على الاوساط الزرعية  من إجمالي 150 عينة. تم تحديد اختبار حساسية المضادات الحيوية (AST) لجميع العزلات البكتيرية التي تم الحصول عليها من123 (85.16%)  بطريقة انتشار القرص (طريقة كيربي-باور) وتم تاكيده باستخدام جهاز Vitek- 2Compact System.

تم اختبار حساسية البكتيريا المعزولة مقابل 10 مضادات حيوية لكل بكتيريا. أظهرت النتائج أن Staphylococcus aureus و Staphylococcus epidermidis مقاومة عالية لـ Gentamicin (77.3 %) Clindamycin  (76.5 %)، ومقاومة منخفضة Clarithromycin  (31.8 %), Doxycycline (37%)  على التوالي. بينما أظهرت عزلات Acinetobacter baumannii مقاومة عالية لـ Ampicillin (100%) ومقاومة منخفضةAmikacin (53.8%)  وعزلات Pseudomonas aeruginosa مقاومة عاليةAmpicillin (100%)  ومقاومة منخفضة Imipenem (35%) أخيرًا، أظهرت عزلات Escherichia coli مقاومة عالية لـ Ampicillin  (100%)، ومقاومة منخفضة لـ Amikacin (33.34%).

تم إجراء التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية عبر الطرق الخضراء باستخدام مرق استنبات البكتيريا البومانية. تم فحص جسيمات الذهب النانوية المصنعة حيوياً باستخدام إمتصاص الأشعة فوق البنفسجية UV-VIS، و FTIR ، و XRD ، و FESEM ، و AMF، و Tem، وتحليل جهد زيتا. كانت ذروه الامتصاص القوية  بحوالي 574 نانومتر في الأطياف المرئية للأشعة فوق البنفسجية من Ab-AuNPs المركب حيوياً. تم وصف Ab-AuNPs باستخدام FTIR لفحص المجاميع الفعالة التي تشارك في استقرار الجسيمات النانوية في المحلول. أنتج Ab-AuNPs نطاقات قوية عند 3321.42, 2823.79, 2144.84, 1631.78 cm-1 . هذه الاهتزازات تتوافق مع أميد III، عديد ببتيدات، والبروتينات. ساهمت الببتيدات  المتعددة في وسط مرق A. baumannii كعوامل تغطية واستقرار في Ab-AuNPs. القمم الحادة المحددة في النطاق (578.64–748.38) cm-1 تشير: إلى اهتزاز Ab-AuNPs ، تعني هذه النتيجة أن Ab-AuNPs تم تكوينه بنجاح. يُظهر تحليل حيود الأشعة السينية أن القمم الرئيسية التي تم الحصول عليها عند111, 200, 220,  و  311تتوافق مع الانعكاسات بقيم 2θ لزوايا براغ , 38.18°, 44.51°, 64.80°, 77.72°  على التوالى.

توضح هذه النتائج أن المادة المختبرة هي Ab-AuNPs ولها مستوى نقاء عالٍ جدًا. تم حساب الحجم البلوري لـ Ab-AuNPs في الترتيب (26.82 nm)  باستخدام معادلةDebye Scherrer. أظهرت نتائج فحص TEM أن حجم Ab-AuNPs المركب حيوياً، تراوح بين (20-90) nm، بمتوسط 66 nm. لديهم شكل شبه كروي ويتجمعون معًا. أشارت نتائج FESEM إلى أن شكل وحجم Ab-AuNPs قريب من قراءات  TEM. يتم قياس حجم وشكل Ab-AuNPs بواسطة AFM. تظهر النتائج الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد AFM مع توزيع الحجم المقابل لـ Ab-AuNPs. كان حجم الجزيئات nm ((15-125، بمتوسط طول 66 nm.. كانت نتائج تحليل Zeta المحتمل لـ Ab-AuNPs -22 mV وأقل من 30 mV، مما يشير إلى أن الجسيمات مستقرة ولا تتكتل.

تم إجراء دراسة التركيب الحيوي المضاد للبكتيريا لجسيمات الذهب النانوية ضد عزلات MDR المختارة عن طريق تحضير تركيزات مختلفة(62.5, 125, 250, 500) mg /ml. أظهرت نتائج النشاط المضاد للميكروبات أن قطر منطقة التثبيط انخفض مع انخفاض تركيز AB-AuNPs وأن أعلى منطقة تثبيط للعزلات كانت بتركيز (500) µg/ml. كانت أقل منطقة تثبيط عند التركيز (62.5) µg/ml

 لجزيئات الذهب النانوية المصنعة مع فروق ذات دلالة إحصائية (p <0.01). تم استخدام طريقتين للتحقق من تأثير Ab-AuNPs على تكوين الأغشية الحيوية ضد عزلات MDR المختارة، طريقة اطباق المعايرة الدقيقة وطريقة الفحص المجهري الفلوريسنت باستخدام التراكيز (250) mg /ml أثبتت النتائج فعالية Ab-AuNPs المركب حيوياً في تثبيط إنتاج البيوفيلم في عزلات MDR.

أكد اختبار MTT على خط خلايا سرطان الثدي MCF-7 وسرطان البروستاتا PC-3 النشاط المضاد للسرطان في المختبر. أظهرت Ab-AuNPs نشاطًا سامًا وفعالا ضد خط خلايا سرطان الثدي MCF-7 وسرطان البروستاتا PC3 ولكنها كانت غير فعالة ضد خط الخلية الطبيعي MCF-10. كانت قيم 11.45 µg/ml. = IC50 لـ Ab-AuNPs ضد خط خلايا سرطان الثدي وكان أقصى تركيز مثبط 25, 50 (63.00% and 86.33%), mg/mL على التوالي. أظهر AuNPs تأثيرًا مثبطًا يعتمد على الجرعة على تكاثر الخلايا السرطانية PC-3. كان متوسط الجرعة المميتة

 13.72 µg/ml =IC50، وكان أقصى تركيز مثبط 25, 50 (57.33% and 80.67%) mg/mL على التوالي. أثبتت النتائج أن Ab-AuNPs لها نشاط الكسح الجذري باستخدام طريقة DPPH، والذي يزيد مع زيادة تركيز Ab-AuNPs، حيث أعطت التركيزات3.1, 6.25, 12.5, 25, and 50 µg/ml  نشاط تنظيف لـ DPPH 37.87%, 50.13%, 59.33%, 75.55%,  85.13% على التوالي.

   تم إجراء فحوصات تصور موت الخلايا بوساطة موت الخلايا المبرمج باستخدام تلوين الخلايا بالصبغة المزدوجة والتصور المجهر الفلوري للتعرف على التغييرات في التشكل النووي. فحص قياس التدفق الخلوي للمستوى المحتمل لغشاء الميتوكوندريا بعد تلطيخ الخلايا بمسبار Rh123 بعد العلاج باستخدام Ab- AuNPs في IC50 لمدة 24   ساعة من العلاج. أدت الزيادة الكبيرة في موت الخلايا المبرمج إلى تمزق الغشاء والفجوات الموجودة في الجسيمات الحالة، والتي تتوافق مع استنفاد إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لم يلاحظ أي تغيير بعد معالجة خط الخلية الطبيعي MCF-10.

خلصنا إلى أن Ab-AuNPs المُصنَّع بيولوجيًا له نشاط فعال مضاد للجراثيم ومضاد حيوي يمكن أن يعزز عمل المضادات الحيوية الموجودة ويمكن أن يكون عاملًا علاجيًا، وفي الوقت نفسه، من المهم ملاحظة أن لها تأثيرات مضادة للسرطان عن طريق التسبب في موت الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج. لذلك، يمكن استخدامه بدلاً من العلاجات الأخرى.

وخلصت الطالبة الى التوصيات الاتية :

• فحص الكائنات الحية الدقيقة الأخرى للحصول على جسيمات نانوية أخرى تفيد التطبيقات الطبية الحيوية وتكون صديقة للبيئة.

• تطبيق AuNPs كعوامل مضادة للجراثيم ومضادات حيوية ومضادة للسرطان تنبأ بنشاطاتها المفيدة ضد الكائنات المسببة للأمراض. ومع ذلك ، يجب تقييم آثارها الإجمالية على الخلايا والأنسجة والأعضاء الطبيعية ذات الصلة من أجل التطبيقات العملية على الكائنات الحية المصابة.

• تشخيص أنواع بكتيرية مختلفة من مواقع سريرية أخرى ، وتقييم تأثير AuNPs عليها.

• دراسة الأنشطة المضادة للفطريات والفيروسات والطفيليات من Ab-AuNPs.

• الكشف عن الأنشطة المضادة للسرطان وإيصال الأدوية من Ab-AuNPs في الفئران المسببة للسرطان.

• استخدام NPs الذهب في تطبيقات أخرى مثل أجهزة الاستشعار الحيوية