أطروحة دكتوراه تبحث التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بوساطة ACinetobacter baumannii وتقييم أنشطتها المضادة للبكتيريا والسرطان

ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة – ابن الهيثم أطروحة الدكتوراه الموسومة (  التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بوساطة ACinetobacter baumannii وتقييم أنشطتها المضادة للبكتيريا والسرطان )  للطالبة ( انتصار حميد علي )  التي اجزتها باشراف التدريسي في القسم ( أ.م.د. عصام جاسم خريبط ) ونوقشت من قبل أعضاء لجنة المناقشة المبينة أسمائهم في ما يأتي :

– أ.د. ماجد صخي جابر – رئيسا

– ا.د. هنادي سالم عبد الصاحب – عضوا

– ا.م.د. هند حسين عبيد – عضوا

– أ.م.د. ليث احمد يعقوب – عضوا

– ا.م .د سعاد خليل ابراهيم – عضوا

– ا.م.د عصام جاسم خريبط – عضوا و مشرفا

ويهدف البحث الى استغلال الوسط الزرعي للبكتريا  لأكثر البكتيريا شيوعًا في الجروح والحروق في تصنيع جسيمات الذهب النانوية وتقييم الأنشطة البيولوجية لجسيمات الذهب النانوية المصنوعة حيوياً.

وتم في هذه الدراسة عزل وتشخيص البكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية والتي تنتج غشاءا حيويأ والمعزولة من المرضى المصابين بالجروح والحروق، ومن ثم التركيب الحيوي لجسيمات الذهب النانوية بالطرق الخضراء باستخدام وسط الزرعي للمرق المغذي لبكتريا Acinetobacter baumannii  ودراسة  تاثيره المضاد للبكتريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية  والمضاد لتكوين الغشاء الحيوي وايضا نشاطه المضاد للسرطان كبديل محتمل للعلاجات التقليدية.

تم جمع١٥٠  عينة من إصابات الحروق والجروح من مرضى عراقيين تم إدخالهم إلى مستشفيات مدينة بغداد (مستشفيات المدينة الطبية، ومستشفى اليرموك التعليمي، ومستشفى الكندي التعليمي)، للفترة من   ١/١٢/٢٠٢١ to ٣٠/٣/ ٢٠٢٢.

تم التعرف على العزلات البكتيرية مبدئيًا باستخدام وسط زرعي انتقائي ومن ثم  الفحص المجهري والاختبارات الكيموحيوية واستخدام كت تشخيص البكتريا الذي يعرف ب DIAGNOSTICS s.r.o. ومن ثم التشخيص التأكيدي لهذه العزلات تم بواسطة جهازالفايتك  Vitek- ٢Compact System.

تم تشخيص ثلاثة أنواع من البكتيريا موجبة الجرام وهي:Staphylococcus aureus و Staphylococcus epidermidis و Enterococcus spp. والتي تم عزلها من الجروح بنسبة  ١٠ (٤٥.٤%) , ٩ (٥٩.٥%) , ١ (٢٥%).  في المقابل، تم عزلهم من الحروق بنسبة ١٢ (٥٤.٥%), ٨ (٥٩.٥%), , ٣(٧٥%)، هناك سبعة أنواع تنتمي إلى بكتريا سالبة الجرام النشطة، وهي Acinetobacte baumannii، وPseudomonas aeruginosa، وEscherichia coli، وKlebsiella pneumoniae، وProteus mirabilis، و Burkholderia cepacian، وMorganella morgani التي تم عزلها من الجروح ١٨(٦٩.٢%), ١٤(٧٠%), ٩ (٦٠%), ٣ (٣٠%) ,٢ (٣٣.٣%) (١٠٠%) , ١(١٠٠%),  على التوالي، بالمقابل تم عزلهم من الحروق بنسبة ٨ (٣٠.٧%), ٦(٣٠. %), ٦(٤٠. %), ٧ (٧٠%), ٤(٦٦.٦%), ٠%,  على التوالي.

تم الحصول على ١٢٣ عزلة نقية فقط بعد الزراعة على الاوساط الزرعية  من إجمالي ١٥٠ عينة. تم تحديد اختبار حساسية المضادات الحيوية (AST) لجميع العزلات البكتيرية التي تم الحصول عليها من١٢٣ (٨٥.١٦%)  بطريقة انتشار القرص (طريقة كيربي-باور) وتم تاكيده باستخدام جهاز Vitek- ٢Compact System.

تم اختبار حساسية البكتيريا المعزولة مقابل ١٠ مضادات حيوية لكل بكتيريا. أظهرت النتائج أن Staphylococcus aureus و Staphylococcus epidermidis مقاومة عالية لـ Gentamicin (٧٧.٣ %) Clindamycin  (٧٦.٥ %)، ومقاومة منخفضة Clarithromycin  (٣١.٨ %), Doxycycline (٣٧%)  على التوالي. بينما أظهرت عزلات Acinetobacter baumannii مقاومة عالية لـ Ampicillin (١٠٠%) ومقاومة منخفضةAmikacin (٥٣.٨%)  وعزلات Pseudomonas aeruginosa مقاومة عاليةAmpicillin (١٠٠%)  ومقاومة منخفضة Imipenem (٣٥%) أخيرًا، أظهرت عزلات Escherichia coli مقاومة عالية لـ Ampicillin  (١٠٠%)، ومقاومة منخفضة لـ Amikacin (٣٣.٣٤%).

تم إجراء التخليق الحيوي لجسيمات الذهب النانوية عبر الطرق الخضراء باستخدام مرق استنبات البكتيريا البومانية. تم فحص جسيمات الذهب النانوية المصنعة حيوياً باستخدام إمتصاص الأشعة فوق البنفسجية UV-VIS، و FTIR ، و XRD ، و FESEM ، و AMF، و Tem، وتحليل جهد زيتا. كانت ذروه الامتصاص القوية  بحوالي ٥٧٤ نانومتر في الأطياف المرئية للأشعة فوق البنفسجية من Ab-AuNPs المركب حيوياً. تم وصف Ab-AuNPs باستخدام FTIR لفحص المجاميع الفعالة التي تشارك في استقرار الجسيمات النانوية في المحلول. أنتج Ab-AuNPs نطاقات قوية عند ٣٣٢١.٤٢, ٢٨٢٣.٧٩, ٢١٤٤.٨٤, ١٦٣١.٧٨ cm-١ . هذه الاهتزازات تتوافق مع أميد III، عديد ببتيدات، والبروتينات. ساهمت الببتيدات  المتعددة في وسط مرق A. baumannii كعوامل تغطية واستقرار في Ab-AuNPs. القمم الحادة المحددة في النطاق (٥٧٨.٦٤–٧٤٨.٣٨) cm-١ تشير: إلى اهتزاز Ab-AuNPs ، تعني هذه النتيجة أن Ab-AuNPs تم تكوينه بنجاح. يُظهر تحليل حيود الأشعة السينية أن القمم الرئيسية التي تم الحصول عليها عند١١١, ٢٠٠, ٢٢٠,  و  ٣١١تتوافق مع الانعكاسات بقيم ٢θ لزوايا براغ , ٣٨.١٨°, ٤٤.٥١°, ٦٤.٨٠°, ٧٧.٧٢°  على التوالى.

توضح هذه النتائج أن المادة المختبرة هي Ab-AuNPs ولها مستوى نقاء عالٍ جدًا. تم حساب الحجم البلوري لـ Ab-AuNPs في الترتيب (٢٦.٨٢ nm)  باستخدام معادلةDebye Scherrer. أظهرت نتائج فحص TEM أن حجم Ab-AuNPs المركب حيوياً، تراوح بين (٢٠-٩٠) nm، بمتوسط ٦٦ nm. لديهم شكل شبه كروي ويتجمعون معًا. أشارت نتائج FESEM إلى أن شكل وحجم Ab-AuNPs قريب من قراءات  TEM. يتم قياس حجم وشكل Ab-AuNPs بواسطة AFM. تظهر النتائج الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد AFM مع توزيع الحجم المقابل لـ Ab-AuNPs. كان حجم الجزيئات nm ((١٥-١٢٥، بمتوسط طول ٦٦ nm.. كانت نتائج تحليل Zeta المحتمل لـ Ab-AuNPs -٢٢ mV وأقل من ٣٠ mV، مما يشير إلى أن الجسيمات مستقرة ولا تتكتل.

تم إجراء دراسة التركيب الحيوي المضاد للبكتيريا لجسيمات الذهب النانوية ضد عزلات MDR المختارة عن طريق تحضير تركيزات مختلفة(٦٢.٥, ١٢٥, ٢٥٠, ٥٠٠) mg /ml. أظهرت نتائج النشاط المضاد للميكروبات أن قطر منطقة التثبيط انخفض مع انخفاض تركيز AB-AuNPs وأن أعلى منطقة تثبيط للعزلات كانت بتركيز (٥٠٠) µg/ml. كانت أقل منطقة تثبيط عند التركيز (٦٢.٥) µg/ml

 لجزيئات الذهب النانوية المصنعة مع فروق ذات دلالة إحصائية (p <٠.٠١). تم استخدام طريقتين للتحقق من تأثير Ab-AuNPs على تكوين الأغشية الحيوية ضد عزلات MDR المختارة، طريقة اطباق المعايرة الدقيقة وطريقة الفحص المجهري الفلوريسنت باستخدام التراكيز (٢٥٠) mg /ml أثبتت النتائج فعالية Ab-AuNPs المركب حيوياً في تثبيط إنتاج البيوفيلم في عزلات MDR.

أكد اختبار MTT على خط خلايا سرطان الثدي MCF-٧ وسرطان البروستاتا PC-٣ النشاط المضاد للسرطان في المختبر. أظهرت Ab-AuNPs نشاطًا سامًا وفعالا ضد خط خلايا سرطان الثدي MCF-٧ وسرطان البروستاتا PC٣ ولكنها كانت غير فعالة ضد خط الخلية الطبيعي MCF-١٠. كانت قيم ١١.٤٥ µg/ml. = IC٥٠ لـ Ab-AuNPs ضد خط خلايا سرطان الثدي وكان أقصى تركيز مثبط ٢٥, ٥٠ (٦٣.٠٠% and ٨٦.٣٣%), mg/mL على التوالي. أظهر AuNPs تأثيرًا مثبطًا يعتمد على الجرعة على تكاثر الخلايا السرطانية PC-٣. كان متوسط الجرعة المميتة

 ١٣.٧٢ µg/ml =IC٥٠، وكان أقصى تركيز مثبط ٢٥, ٥٠ (٥٧.٣٣% and ٨٠.٦٧%) mg/mL على التوالي. أثبتت النتائج أن Ab-AuNPs لها نشاط الكسح الجذري باستخدام طريقة DPPH، والذي يزيد مع زيادة تركيز Ab-AuNPs، حيث أعطت التركيزات٣.١, ٦.٢٥, ١٢.٥, ٢٥, and ٥٠ µg/ml  نشاط تنظيف لـ DPPH ٣٧.٨٧%, ٥٠.١٣%, ٥٩.٣٣%, ٧٥.٥٥%,  ٨٥.١٣% على التوالي.

   تم إجراء فحوصات تصور موت الخلايا بوساطة موت الخلايا المبرمج باستخدام تلوين الخلايا بالصبغة المزدوجة والتصور المجهر الفلوري للتعرف على التغييرات في التشكل النووي. فحص قياس التدفق الخلوي للمستوى المحتمل لغشاء الميتوكوندريا بعد تلطيخ الخلايا بمسبار Rh١٢٣ بعد العلاج باستخدام Ab- AuNPs في IC٥٠ لمدة ٢٤   ساعة من العلاج. أدت الزيادة الكبيرة في موت الخلايا المبرمج إلى تمزق الغشاء والفجوات الموجودة في الجسيمات الحالة، والتي تتوافق مع استنفاد إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لم يلاحظ أي تغيير بعد معالجة خط الخلية الطبيعي MCF-١٠.

خلصنا إلى أن Ab-AuNPs المُصنَّع بيولوجيًا له نشاط فعال مضاد للجراثيم ومضاد حيوي يمكن أن يعزز عمل المضادات الحيوية الموجودة ويمكن أن يكون عاملًا علاجيًا، وفي الوقت نفسه، من المهم ملاحظة أن لها تأثيرات مضادة للسرطان عن طريق التسبب في موت الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج. لذلك، يمكن استخدامه بدلاً من العلاجات الأخرى.

وخلصت الطالبة الى التوصيات الاتية :

• فحص الكائنات الحية الدقيقة الأخرى للحصول على جسيمات نانوية أخرى تفيد التطبيقات الطبية الحيوية وتكون صديقة للبيئة.

• تطبيق AuNPs كعوامل مضادة للجراثيم ومضادات حيوية ومضادة للسرطان تنبأ بنشاطاتها المفيدة ضد الكائنات المسببة للأمراض. ومع ذلك ، يجب تقييم آثارها الإجمالية على الخلايا والأنسجة والأعضاء الطبيعية ذات الصلة من أجل التطبيقات العملية على الكائنات الحية المصابة.

• تشخيص أنواع بكتيرية مختلفة من مواقع سريرية أخرى ، وتقييم تأثير AuNPs عليها.

• دراسة الأنشطة المضادة للفطريات والفيروسات والطفيليات من Ab-AuNPs.

• الكشف عن الأنشطة المضادة للسرطان وإيصال الأدوية من Ab-AuNPs في الفئران المسببة للسرطان.

• استخدام NPs الذهب في تطبيقات أخرى مثل أجهزة الاستشعار الحيوية