ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة ( تقييم فعالية انزيم البروميلين المحمل على دقائق الفضة النانوية في التئام الجروح ودراسة بعض المتغيرات الوظيفية والمناعية والنسجية في ذكور الفئران البيض Mus musculus ) للطالب ( محمد عبدالرزاق عاشج حسين ) التي انجزها باشراف التدريسية في القسم ( أ.د. هنادي سالم عبد الصاحب ) ونوقشت من قبل لجنة المناقشة المبينة في ما يأتي ::
ا.د. انتظار محمد مناتي – رئيساً
ا.م.د. نضال ابراهيم لطيف – عضواً
ا.م.د. رشا كريم محمد – عضواً
ا.د. هنادي سالم عبد الصاحب – عضواً ومشرفاً
نظراً لقلة الدراسات الخاصة باختيار وسيلة لتوصيل العلاج الى الانسجة والخلايا المستهدفة، فقد اُعِدَت الدراسة الحالية لتقييم فعالية انزيم البرومياين المحمل على دقائق الفضة النانوية كعلاج بديل لتسريع التئام الجروح ودراسة بعض المتغيرات الوظيفية والمناعية والنسجية ولتحقيق هدف الدراسة تم اجراء الخطوات الاتية :-
- تحضير دقائق الفضة النانوية AgNPs باستعمال الطريقة الكيميائية وربط وتحميل انزيم البروميلين على دقائق الفضة النانويةBr-AgNPs .
- اجراء بعض التجارب للتأكد من الخصائص النانوية تتضمن مطياف الاشعة المرئية وفوق البنفسجيةUV-vis ، مطياف الاشعة تحت الحمراء FTIR، المجهر الالكتروني الماسح للانبعاث المجالي FE-SEM وقياس حيود الاشعة السينية XRD.
- تقدير الفعالية المضادة للأكسدة للمواد المحضرة باستعمال الجذر الحر DPPH.
- تقدير الفعالية المضادة للبكتريا للمواد المحضرة.
- استحداث جروح تجريبية في الفئران لتطبيق الموضوع قيد الدراسة.
- التحقق من تأثير المواد التجريبية في بعض المعايير الدموية من خلال الكشف عن تعداد الدم الكامل في حيوانات التجربة.
- التحقق من مستوى بروتينات النسيج الضام في مصل الدم وتتضمن الكشف عن مستوى البروتين الرابط الليفي Fibronectin و بروتين المغراء النوع الثالث Collagen III .
- دراسة سرعة التئام الجروح مظهرياً وقياسياً مع اجراء التقطيع النسجي للجلد الملتئم.
اجريت الدراسة الحالية لتقييم فعالية انزيم البروميلينBromelain المحمل على دقائق الفضة النانوية في التئام الجروح في الفئران البيض Mus musculus ، وتضمنت الدراسة ثلاثة محاور رئيسة، المحور الاول هو تحضير دقائق الفضة النانوية و تحميل انزيم البروميلين عليها ثم تشخيص الدقائق النانوية المحضرة قبل وبعد تحميل انزيم البروميلين. اما المحور الثاني هو الدراسة المختبرية In vitro وتشمل دراسة فعالية كسح الجذور الحرة لكلً من محلول البروميلين ودقائق الفضة النانوية ودقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين. ودراسة الفعالية المضادة للبكتريا للمواد نفسها اتجاه انواع من البكتريا الموجبة والسالبة لصبغة گرام. والمحور الثالث يمثل دراسة داخل الجسم الحي In vivo إذ اجريت الدراسة الحالية على 20 فأراً ذكراً تراوحت اوزانها بين 25-20 غرام ، وزعت الحيوانات بصورة عشوائية على خمس مجاميع تضمنت اربع فئران لكل مجموعة ، المجموعة الاولى تمثل السيطرة السلبية غير المعاملة باي مادة والمجموعة الثانية تمثل السيطرة الايجابية المعاملة بمرهم سلفاديازين الفضة والمجموعة الثالثة معاملة بمحلول البروميلين والمجموعة الرابعة معاملة بدقائق الفضة النانوية والمجموعة الخامسة معاملة بدقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين وفي هذا المحور تم دراسة جانبين الاول هو دراسة وظيفية ومناعية وتتضمن الكشف عن تأثير المواد التجريبية في تعداد الدم الكامل ويشمل تعداد خلايا الدم البيض وكريات الدم الحمر والصفيحات الدموية والتحقق من مستوى الهيموكلوبين واختبار الهيماتوكريت وحجم الكرية الوسطي وهيموغلوبين الكرية الوسطي. كما تم التحقق من مستوى البروتين الرابط الليفي وبروتين المغراء النوع الثالث في مصل الدم لحيوانات التجربة . اما الجانب الثاني فهو دراسة مظهرية ونسجية للجروح الملتئمة.
بينت نتائج تحضير دقائق الفضة النانوية تغير لوني لمحلول نترات الفضة من اللون الشفاف (عديم اللون) إلى البُني مما يشير الى تكون دقائق الفضة النانوية ثم تغير لون المحلول الى البُني الفاتح بعد إضافة محلول البروميلين مما يشير الى تحميل البروميلين. اظهر فحص مطياف الاشعة المرئية وفوق البنفسجية قمة عند 440 نانومتر لدقائق الفضة النانوية و 448 نانومتر لدقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين، وكشف فحص مطياف الاشعة تحت الحمراء عن مجاميع فعالة مشتركة بين محلول البروميلين ودقائق الفضة النانوية منها مجاميع الهيدروكسيل والمجاميع الفعالة للاميدات والامينات الاولية والثانوية. وأظهر فحص المجهر الالكتروني الماسح للانبعاث المجالي ان دقائق الفضة النانوية كانت ذات اشكال كروية وموزعة توزيعاً منتظماً وسطوحها ملساء وبمتوسط حجم يتراوح بين 61.30-41.33 نانومتر وبعد تحميل البروميلين كان الحجم يتراوح بين82.91-39.84 نانومتر. كشف فحص حيود الاشعة السينية ان دقائق الفضة النانوية ودقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين ذات تركيب بلوري مكعب متمركز الوجه .
اظهرت النتائج إن كلً من محلول البروميلين ودقائق الفضة النانوية ودقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين ذات فروقاً معنوية عند مستوى احتمالية P≤ 0.05 في امكانية كسح الجذور الحرة بطريقة تعتمد على الجرعة إذ تم استعمال التراكيز 200, 100, 50, 25 مايكرولتر/ مليلتر وكان اعلى معدل لنشاط الكسح عند التركيز 200 مايكرولتر/ مليلتر وبمعدل 60.185±7.76 % للبروميلين و 82.33±5.62 % لدقائق الفضة النانوية و 67.98±6.72 % لدقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين. اظهرت النتائج فعالية تثبيط ضد البكتريا ايضاً لكلً من محلول البروميلين ودقائق الفضة النانوية ودقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين على التوالي بمساحة تثبيط قدرها9 ،16 ،16 مليمتر ضد بكتريا المكورات العنقودية الذهبية Staphylococcus.aureus الموجبة لصبغة گرام وضد البكتريا السالبة لصبغة گرام المتمثلة بالكليبسلا الرئوية klebsiella.pneumoniae بمساحة تثبيط قدرها 10، 12، 14 مليمتر. والاشريكية القولونية Escherichia.coli بمساحة تثبيط هي 8، 12،13 مليمتر. بينت النتائج ان دقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين هي الاكثر كفاءة في تثبيط نمو الانواع البكتيرية الموجبة والسالبة لصبغة گرام مقارنةً مع محلول البروميلين ودقائق الفضة النانوية.
كما اظهرت النتائج ان هناك فروق معنوية عند مستوى الاحتمالية (P≤0.05) بين المجاميع التجريبية في تأثير المواد التجريبية في معايير الدم بالمقارنة مع المجموعة الاولى المتمثلة بالسيطرة السلبية إذ وجد ارتفاع معنوي في خلايا الدم البيض في المجموعة الرابعة وانخفاض معنوي في كريات الدم الحمر في المجموعة الثالثة والرابعة، كما بينت النتائج انخفاضاً معنوياً في الصفيحات الدموية في كل من المجموعة الثالثة والخامسة فضلاً عن وجود ارتفاع معنوي في كل من حجم الكرية الوسطي وهيموغلوبين الكرية الوسطي لكل من المجموعة الثالثة والرابعة و الخامسة ولم يكن هناك فرقاً معنوياً في مستوى الهيموكلوبين واختبار الهيماتوكريت.
اظهرت النتائج ان هناك فروقاً معنوية في مستوى البروتين الرابط الليفي في مصل الدم إذ كان هناك ارتفاعاً معنوياً عند مستوى احتمالية (P≤0.047) في مستوى البروتين الرابط الليفي في كل من المجموعة الثالثة والمجموعة الخامسة مقارنتاً مع مجموعة السيطرة السلبية بمعدل 7132.52±324.67 و7006.67±565.19 و3569.60±571.75 بيكوغرام / مليلتر على التوالي بينما لم تظهر فروق معنوية في المجاميع الاخرى، فضلا عن ذلك وجد انخفاض معنوي في المجموعة الرابعة وبمعدل 3383.67±312.66 بيكوغرام / مليلتر مقارنةً مع المجموعة الثالثة والخامسة. كما وجدت فروق معنوية في مستوى بروتين المغراء النوع الثالث عند مستوى احتمالية (P≤0.05) في مجاميع الدراسة الحالية كلها، إذ وجد ارتفاع معنوي في كل من المجموعة الرابعة والمجموعة الخامسة مقارنة مع مجموعة السيطرة السلبية وبمعدل5.90±0.13 و5.78±1.23 و2.13±0.38 نانوغرام / مليلتر على التوالي. بينما لم يكن هناك فروقاً معنوية بين المجموعة الثانية والمجموعة الثالثة بمعدل 3.36±0.12 و3.00±0.56 نانوغرام / مليلتر على التوالي مقارنةً مع مجموعة السيطرة السلبية. فضلا عن وجود ارتفاع معنوي في كل من المجموعة الرابعة والخامسة مقارنةً مع المجموعة الثانية والثالثة.
كما اظهرت نتائج اختبار التئام الجروح في الجسم الحي فروقاً معنوية في كل المجاميع المعاملة بالمواد التجريبية لاسيما المجموعة الثانية وبشكل اكثر في المجموعة الخامسة مقارنةً مع مجموعة السيطرة السلبية. سَجلت نتائج الدراسة انخفاض معنوي عند مستوى الاحتمالية (P≤0.05) في طول الجرح للمجموعة الخامسة في بداية التجربة، و سجل انخفاض معنوي بعد 24 ساعة عند مستوى الاحتمالية(P ≤0.001) لكل المجاميع التجريبية، وفي نهاية التجربة وجد انخفاض معنوي في طول الجروح عند مستوى الاحتمالية(P≤0.001) للمجموعة الخامسة. ولوحظ في اليوم الاخير من التجربة وجود فروق في فعالية تسريع التئام الجروح لكل من البروميلين ودقائق الفضة النانوية ودقائق الفضة النانوية المحملة بالبروميلين في حيوانات التجربة مقارنةً مع مجموعة السيطرة السلبية والايجابية إذ كشفت نتائج مجموعة السيطرة السلبية عن تنخر نسجي والتهاب جلدي في البشرة ونسيج حبيبي يتضمن خلايا التهابية في الادمة. وكشفت نتائج مجموعة السيطرة الايجابية عن نمو طبيعي لكل من البشرة والادمة. كما كشفت نتائج المجموعة الثالثة عن سمك طبيعي للبشرة والياف مغراوية منتظمة في الادمة مع وجود جريبات الشعر وارومات ليفية. وكشفت نتائج المجموعة الرابعة عن علامات التهاب بسيطة في البشرة وحزم من الالياف المغراوية وارومات ليفية في الادمة. وتكشف نتائج المجموعة الخامسة عن سمك طبيعي للبشرة ونسيج ضام ليفي كثيف يحتوي الياف مغراوية تتخللها ارومات ليفية عديدة ولوحظ بعض من جريبات الشعر النامية.
خَلُصَت الدراسة الحالية إلى أن تحميل انزيم البروميلين على دقائق الفضة النانوية انتج تأثيراً تازرياً لكل من البروميلين ودقائق الفضة النانوية بشكل دقائق فضة نانوية محملة بالبروميلين في تسريع عملية التئام الجروح من خلال دعم الفعالية المضادة للاكسدة والفعالية المضادة للبكتريا والتاثيرات الايجابية في معايير الدم والمساهمة في تقليص طول الجروح وتسهيل انتشار وهجرة الخلايا الرئيسة في عملية الالتئام
استناداً الى ما افرزته نتائج الدراسة الحالية نوصي بضرورة اجراء المزيد من الدراسات ضمن الجوانب الاتية :-
- تحميل انزيم البروميلين مع انواع اخرى من الدقائق النانوية كنواقل للعلاجات المختلفة مثل استعمال دقائق الذهب النانوية او دقائق الكيتوسان النانوية نظرا للفعاليات العلاجية العديدة لإنزيم البروميلين.
- استعمال الطريقة البيولوجية أو الخضراء لتحضير دقائق الفضة النانوية باستعمال الأنزيمات المحللة للبروتين مثل البروميلين ودراسة فعاليات علاجية متنوعة لها مثل الفعالية المضادة للبكتريا المقاومة و فعالية كسح الجذور الحرة.
- دراسة تأثير البروميلين المحمل على دقائق الفضة النانوية في مستوى بروتينات النسيج الضام المتخصصة مثل بروتين الليفين Fibrin والبنيوية مثل بروتين المرنين Elastine.
- دراسة فعالية البروميلين المحمل على دقائق الفضة النانوية في تسريع التئام الجروح في الحيوانات المصابة بالامراض المزمنة مثل داء السكري الذي يسبب مشاكل في التئام الجروح.
- دراسة تاثير انزيم البروميلين المحمل على دقائق الفضة النانوية في نسج اعضاء اخرى كالكلية والكبد والدماغ.
- اجراء دراسة باستعمال طرق تعرض اخرى غير الطريقة المعتمدة في الدراسة الحالية كالحقن داخل الصفاق او التجريع.
