ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) رسالة الماجستير الموسومة ( دراسـة بكتريولوجيـة وجزيئيـة لبكتريا المكورات العنقوديـة الذهبيـة والمعزولـة من مصادر سريريـة مختلفـة ) للطالبة ( نـور جبـار عباس ) التي انجزتها تحت اشراف التدريسي في القسم ( م.د. محمد عبـاس فيـاض ).
وتم في هذا البحث الحصول على 120 عينة مرضية من بعض مستشفيات بغداد ، خلال المدة من 18/10/2018 لغاية 8/1/2019 ، شخصت 43 عزلة تعود إلى جنس S. aureus ، إعتمادا على الطرائق التشخيصية التقليدية ، ثم شخصت العزلات باستعمال جهاز الفايتك Vitek-2 Compact system.
إختُبِرت حساسية الـ 43 عزلة اتجاه 15 مضاداً حيويا تعود إلى أنواع مختلفة من عوائل المضادات، باعتماد طريقة الاقراص، وكانت أعلى نسبة للمقاومة سجلت لمضاد الميثيسلين MEوبنسبة مئوية 95.3%، في حين انعدمت المقاومة لمضاد الفانكومايسين ، فيما سجلت النسب المئوية للمقاومة للـمضادات اوكزاسايكلين (72%) OX، الجنتامايسين (55.8%) CN،الارثرومايسين (37.2%) E ، الازثرومايسين (34.8%)AZM ، المثبريم (30.2%) TMP ،التتراسايكلين (27.9%) TE.كما أظهرت بقية المضادات نسب مئوية متدنية للمقاومة .
تم استعمال جهاز الفايتك لقياس قيم التراكيز المثبطة الدنيا للمضادات (MICs) لتأكيد اختبار الحساسية بوساطة الأقراص. وكانت نتائج هذه الطريقة مطابقة تماما لنتائج (الأقراص) في جميع المضادات ، ما عدا مضاد Trimethoprim ، إذ أظهرت عزلتان مقاومتها للمضاد بطريقة الأقراص فيما كانت جميع العزلات حساسة عند استعمال جهاز Vitek-2 . وقد يكون السبب تغاير تركيز المضاد المستعمل في كلا الطريقتين أو إن مكونات قرص المضاد تختلف بعض الشيء عن نظيره المتوفر في جهاز .Vitek-2
تم دراسة قابلية الـ 43 عزلة بكتيرية المحلية التي تعود لجنس S.aureus ،على انتاج إنزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف ، إذ أظهرت نتائج الاختبار قدرة 14 عزلة فقط (أي بنسبة %32.5 من مجموع العزلات) على انتاج إنزيمات البيتالاكتاميز واسعة الطيف،فيما لم تظهر العزلات الاخرى نتيجة موجبة والتي هي عبارة عن تداخل مناطق التثبيط مع بعضها البعض .
اما عن امتلاك 43 عزلة بكتيرية لمضخات الدفق التي تعبر عن كفاءة المقاومة للمضادات الحيوية ، فقد كشف مظهريا عنها بطريقة العجلة الخشبية وباستعمال صبغة بروميد الاثيديوم (CW ETBr) Ethidium Bomide-Agar Cartweel Method ، واظهرت النتائج إن جميع عزلات الدراسة أعطت نتائج ايجابية مع تفاوت تألقها في التركيز0.5µ/ml ، كما كانت متألقة أيضا في جميع التراكيزالاخرى دلالة على قوة مضخات الدفق التي تمتلكها .
اما الدراسة الجزيئية فقد شملت ثلاثة محاور رئيسة :
شمل المحور الاول التشخيص الجزيئي لعزلات الدراسة باستعمال بوادئ الجين 16S rRNA ، اذ أكدت النتائج إن جميع العزلات التي تم اختيارها والتي صنفت سابقاً اعتماداً على صفاتها المظهرية وفعاليتها الكيموحيوية، فضلاً عن نتائج Gp- Vitek-2 بأنها تمثل S.aureus جينياً.
اما المحور الثاني فقد تضمن الكشف عن جينات المقاومة للمضادات الحيوية في جميع العزلات ، وتمثلت باستعمال بوادئ خاصة تشفرعن جين المقاومة لمضاد المثيسيلينgene mecA، اذ اوضحت النتائج إن جميع العزلات تمتلك جين mecA ، ما عدا عزلتين اثنتين لا تمتلكان هذا الجين .كما تم الكشف عن جينات المقاومة لمضاد الارثرومايسين في 16 عزلة مقاومة للارثرومايسين باستعمال ثلاثة بوادئ خاصة للجينات التي تشفر صفة المقاومة للارثرومايسين وهي ermC و ermB وermA ، وبينت النتائج أن ermA gene موجود في عزلة واحدة فقط ، بينما يوجد الجين ermB في 14 عزلة (اي نسبة 87.5%) و فيما كان الجين ermC قد ظهر في 11 عزلة ( اي نسبة 68.75% ) من مجموع العزلات المقاومة للارثرومايسين.
بينما تضمن المحور الثالث الكشف عن الجينات المسؤولة عن امتلاك العزلات لمضخات الدفق Efflux pumps والمتمثلة باستعمال بوادئ خاصة للجينات وهي norA gene و . norB gene أظهرت نتائج الكشف الجيني إن جميع العزلات (43) تمتلك الجين norA بينما الجين norB في (38) عزلة فقط.
وللوقوف على نوع وشكل التسلسل للتتابعات الجينية في العزلات المحلية قيد الدراسة ،فقد تم اختيار اربع عزلات لمعرفة تسلسلها التتابعي للجين 16S rRNA ، وكذلك معرفة التسلسل التتابعي للجينات ermA, ermB and ermC . وقد سجلت النتائج المبدئية وجود نسب من الفروقات المئوية مع العزلات العالمية المحفوظة في بنك الجينات العالمي ، فضلا عن وجود عددا من طفرات الاستبدال والاستحداث والحذف في تسلسل القواعد النتروجينية في دنا الجينات للعزلات المحلية المنتخبة ، مما يشجع على تسجيلها كعينات محلية مميزة في بنك الجينات العالمي ، فضلا عن اجراء المزيد من الدراسات والبحوث للعزلات المحلية الاخرى .
نتائج هذه الدراسة تؤكد ان انتشار الكثير من السلالات البكتيرية المرضية التي تعود للنوع S.aureus في العراق، تتغاير فيما بينها في الخصائص الكيموحيوية ، فضلا عن اختلاف مقاومتها للمضادات الحيوية ،الى جانب تغايرها جينبا . مما يتطلب اجراء الكشوفات الضرورية للمرضى المصابين قبل اخذ العلاج اللازم. كما ان الدراسة الاولية لتتابعات الجينات المتسلسلة ، قد تعطي نتائج تفسر التزايد المستمرفي نسب المقاومة للمضادات الحيوية في العزلات البكتيرية التي تعود للنوع S.aureus محليا وعالميا.
Bacteriological and Molecular Study of
Staphylococcus aureus
lsolated From Different Clinical Sources
by NOOR JABBAR ABBAS
Supervised by Dr. MOHAMMED A. FAYIDH
Abstract
From 120 patient samples obtained from some hospitals in Baghdad, during the period from 18/10/2018 to 8/1/2019, 43 isolates belonging to the genus S. aureus were diagnosed, based on traditional diagnostic methods, then diagnosed isolates using Vitek device -2 Compact system
The sensitivity of the 43 isolates to 15 antibiotics due to different antibiotic family were tested using the diffusion disc tablet method, the highest resistance was recorded for the Methicillin ME 95.3%, whereas the resistance to Vancomycin was non-existent, while the percentage of resistance to Oxacillin (OX) was 72%, Gentamicin (CN) (55.8%), Erythromycin(E) (37.2%), Azithromycin (AZM) (34.8%), Trimethoprim TMP (30.2%), Tetracycline (TE) (27.9%), and other antibiotics showed low resistance percentages
To confirm the sensitivity test by tablets, the Vitek device was used to measure the values of the minimum inhibitor concentration (MIC). The results of this method were exactly the same as the results of the method of spreading using tablets in all antidotes, except Trimethoprim, where two isolates showed their resistance to the method of tablets while all isolates were sensitive when using Vitek-2. The cause may be the heterogeneity of the antibiotic concentration used in both methods, or that the components of the antibiotic tablet are somewhat different from those available in Vitek-2
The susceptibility of the 43 local bacterial isolates of S. aureus to the production of broad-spectrum beta-lactamase enzymes was studied. The test results showed that only 14 isolates (32.5% of the total isolates) were able to produce broad spectrum beta-lactamase enzymes. The rest of the isolates did not show a positive result, which is the overlap of the inhibition areas with each other
As for the possession of 43 bacterial isolates of the Efflux pumps that reflect the efficiency of resistance to antibiotics, it was revealed in morphologically using the Cartwheel Method with the dye Ethidium bromide-Agar, (CW ETBr) Ethidium Bromide. The results showed that all isolates of the study, gave positive results through their brightness varied in the concentration of 0.5µ / ml, and they were also radiant in all concentrations indicating the power of the Efflux pumps they possess
The molecular study included three main axes
The first axis included the molecular diagnosis of the study isolates using the 16S rRNA gene primers. The results confirmed that all the selected isolates were previously classified based on their phenotypic characteristics and biochemical efficacy, as well as the results of Gp- Vitek-2 as genetically representative S.aureus
The second axis included the detection of antibiotic resistance genes in all isolates. They were represented by the use of special primers that encode the gene mecA resistance gene. The results showed that all isolates possessed the mecA gene, except for two isolates that did not possess this gene. The genes of resistance to erythromycin were also detected in 16 erythromycin-resistant isolates using three special precursors for genes that encode the erythromycin-resistant characteristic of ermC, ermB and ermA. Results show that ermA gene exists in only one isolation, while the ermB gene was found in 14 isolates (87.5%), and the ermC gene appeared in 11 isolates (68.75%) of the total erythromycin resistance
The third axis included the detection of genes responsible for the isolation of Efflux pumps, represented by the use of special gene primers, norA gene. norB gene The results of genetic detection showed that all isolates (43) possessed the norA gene, while the norB gene in (38) isolation only
To determine the sequence type and shape of the sequences in the local isolates under study, four isolates were selected for sequencing 16S rRNA, as well as sequencing of ermA, ermB and ermC genes
Initial results recorded percentages of differences with the global isolates preserved in the GeneBank of NCBI, as well as a number of mutations of replacement, and deletion in the sequence of nitrogenous bases in the gene DNA of elected local isolates. This encourages their registration as distinct local samples at GeneBank of NCBI, as well as further studies and research for other local isolates
The results of this study confirm the prevalence of many bacterial strains of S. aureus in Iraq, varying in biochemical characteristics, as well as their resistance to antibiotics, as well as genetically different. This requires the necessary tests to be carried out for the injured patients before taking the necessary treatment. A preliminary study of sequential gene sequences may give results that explain the continued increase in antibiotic resistance ratios in bacterial isolates of S. aureus locally and internationally
