مناقشة رسالة طالبة الماجستير هدى هاتف اغائي من قسم علوم الكيمياء

تمت على قاعة المرحوم الاستاذ الدكتور فهد علي حسين المناقشة العلنية لرسالة طالبة الماجستير هدى هاتف اغائي من قسم علوم الكيمياء و الموسومة :

تنقية جزئية لانزيم الليوسين أمينو ببتيديز Leucine aminopeptidase ودراسة بعض المتغيرات  الحيوية في امصال مرضى اضطراب الغدة الدرقية

 

حيث تالفت لجنة المناقشة من الذوات المدرجة اسمائهم فيما يلي :

1. أ.د. نزار احمد ناجي        رئيسا

2. أ.م.د. ازهار عباس اسماعيل عضوا

3. أ.م.د. رشا زهير جاسم عضوا

4. أ.م.د. نورهان خالد شفيق عضوا و مشرفا

 

تهدف هذه الدراسة إلى تنقية جزيئيه  لانزيم الليوسين امينوببتيديز( ( LAPمن امصال المرضى المصابين بفرط  وقصورنشاط الغدة الدرقية.

في هذه الدراسة ،. تم جمع خمسين عينة مصل من اشخاص اصحاء ومائتين عينة مصل من اشخاص مرضى ، وزعت عينات الاشخاص المرضى إلى أربع مجموعات تتألف من (50) عينة لمرضى مصابين بفرط نشاط الغدة الدرقية و (50) عينة لمرضى مصابين بقصور الغدة الدرقية و (50) عينة لمرضى مصابين بفرط نشاط الغدة الدرقية دون السريري و (50) عينة لمرضى مصابين بقصور الغدة الدرقية دون السريري . تراوحت أعمار جميع المرضى بين (15- 60) سنة مع مؤشر كتلة الجسم  (25- 31) كغم / م ². تم جمع العينات خلال الفترة من بداية شهر  تشرين الثاني عام 2017 حتى اوخر شباط  عام 2018  من مركز الغدد الصم والسكري في بغداد.

اشتملت الدراسة على تنقيه جزيئيه لانزيم الليوسين امينوببتديز من امصال المرضى المصابين بفرط  وقصورنشاط الغدة الدرقيه بعدة خطوات تضمنت  اولاالترسيب بكبريتات الامونيوم بنسبة اشباع (%75-%35 ) , ثم  تقنية كروماتوكرافيا التبادل الأيوني باستخدام المبادل  (دي إي أي إي-سيفاروز) وعمود فصل ذو الابعاد (16 *1.5 ) سم الذي كشف عن  اربع حزم بروتين , فقط اثنين من الحزم كانت تمتلك فعالية انزيم الليوسين امينوببتديز، تم تحميل الاجزاء التي تحتوي على نشاط الانزيم من كل حزمه على عمود (سيفاروز-6ب) حيث تم الحصول على حزمة بروتين واحدة ذات فعالية لانزيم الليوسين امينوببتديز .

 اظهرت نتائج الترحيل الكهربائي بوجود المواد الماسخه للبروتين  حزمة بروتين واحدة فقط لكل حزمه وزن جزيئي بحدود(~130~ ,63 كيلودالتون) الانزيم المنقى من امصال المرضى المصابين بفرط نشاط الغدة الدرقية و( ~ 125  ~ ,61  كيلودالتون) مع حزمة واحدة للانزيم المنقى من امصال المرضى المصابين بقصور نشاط الغدة الدرقية حيث ان ذلك يمكن ان يفسر ان هذه الحزم تكون ثنائي واحادي للانزيم مع عدد مرات التنقيه       ( 14,13  –  19,88) و ناتج ( 29,72 – 31,25 ) لفرط نشاط الغدة الدرقية و قصور نشاط الغدة الدرقية على التوالي .

لقد تضمنت الدراسة  ايضا تقييم بعض المعايير الكيمياحيوية مثل ( TSH  و FT3  و FT4  و LAP  وبعض مضادات الأكسدة Malondialdehyde ،  (Peroxynitrite في امصال المرضى المصابين ب (فرط نشاط الغدة الدرقية دون السريري و فرط نشاط الغدة الدرقية و قصورنشاط الغدة الدرقية دون السريري و قصور نشاط الغدة الدرقية) ومقارنة نتائجها مع نتائج  امصال الاشخاص الاصحاء.

كانت هناك زيادة معنوية (p≤0.001)  في مستويات  LAP و peroxynitrite و MDA  ووجد انخفاض معنوي كبير (p≤0.001)  في مستوى TSH  في مجموعة  فرط نشاط الغدة الدرقية دون السريري مقارنة  مع مجموعة الاصحاء ، وعدم وجود فروق معنويه في  مستويات FT3 و FT4.

 اما نتائج مرضى فرط نشاط الغدة الدرقية أظهرت ارتفاعا معنويا كبيرا (p≤0.001) في  مستويات  FT₃  و FT₄  و LAP  و   peroxynitrite و MDA في مجموعة المرضى مقارنة مع مجموعة الاصحاء, بينما وجد انخفاض معنوي في مستوى مؤشركتلة الجسم  وانخفاض  معنوي كبير((p≤0.001   في  مستوى TSH في مجموعة المرضى مقارنة  مع مجموعة الاصحاء.

 كانت هناك زيادة معنوية  (p≤0.001) في مستويات  TSHو  LAP و peroxynitrite و MDA في مجموعة  قصورنشاط الغدة الدرقية دون السريري مقارنة مع مجموعة الاصحاء مع عدم وجود فروق معنويه في  مستويات FT3 و FT4  .

واظهرت نتائج مجموعة  قصور نشاط الغدة الدرقية انخفاضًا معنويا كبيرًا  p≤0.001)  ) في مستويات FT3 و FT4 كما وجد ارتفاعا معنويا في مستوى مؤشر كتلة الجسم وارتفاعا معنويا كبيرا (p≤0.001 ) في مستويات TSH  و LAP  و peroxynitritr و MDA مقارنة مع  مجموعة الاصحاء.

أظهر معامل الارتباط ( r ) بين مستوى LAP والمعايير الأخرى المحسوبة بمؤشر الانحدار في مرضى فرط نشاط الغده الدرقية  دون السريري وجود ارتباطات موجبة  معنويه بين LAP مع FT3 و  FT4في مجموعة الاصحاء وارتباطات سلبية معنويه  في مجموعة المرضى ، كما كشفت النتائج  ارتباطا سلبيا معنويا بين LAP  و TSH في مجموعة الاصحاء والمرضى .

اما نتائج مجموعة فرط نشاط الغدة الدرقية  اظهرت ارتباطًا موجبًا معنويا بين LAP و FT3 في مجموعة الاصحاء ومجموعة المرضى , وكشفت  النتائج عن ارتباط موجب معنوي بين LAP و FT4 في مجموعة الاصحاء وارتباط سلبي معنوي في مجموعة المرضى ، بالاضافة الى ذلك ، أظهرت النتائج ارتباطًا سلبيًا معنويا لـ LAP مع TSH في مجموعة الاصحاء وارتباطا إيجابيا معنويا في مجموعة المرضى.

كشفت نتائج  مجموعة قصور نشاط الغدة الدرقية دون السريري ارتباطا موجبا معنويا لـ LAP مع FT3  و FT4 في مجموعة الاصحاء والمرضى وارتباطا سلبيا معنويا لـ LAP مع TSH في مجموعة الاصحاء و المرضى .

كشفت نتائج مجموعة قصورنشاط الغدة الدرقية ارتباطا موجبا معنويا بين LAP و FT3  في مجموعة الاصحاء وارتباطا سلبيا في مجموعة المرضى في حين تم الكشف عن ارتباط موجب معنوي لل LAP مع FT4 في مجموعة الاصحاء والمرضى ، كذلك، أظهرت النتائج ارتباطا سلبيا معنويا لل LAP مع TSH في مجموعة الاصحاء ، وارتباطا موجبا معنويا في مجموعة المرضى.

هذه هي الدراسة الأولى لتنقية انزيم ليوسين امينوببتيديز (LAP) من مرضى الغدة الدرقية. من الممكن أن يكون الإنزيم قد تم تنقيته في كل من شكليه الثتائي والاحادي . بعض المعلمات البيوكيميائية مثل LAP ، pyroxenitrite ، و MDA التي ارتبطت مع هرمون الغدة الدرقية في مجموعة المرضى تشير إلى أن هذه المعايير لها تأثير على هذه الأمراض.

---

The MSc thesis discussion of student (Huda Hatif Aghaiy) from department of Chemistry

At the hall of the late prof.Dr.Fahad Ali Hussein, The MSc thesis discussion of student (Huda Hatif Aghaiy) from department of Chemistry entitled (Partial Purification of Leucine aminopeptidase and study some Biochemical parameters in Thyroid dysfunction sera) has been discussed

The discussion committee:-

Prof.Dr.Nazar Ahmed Naji    head

Asst.prof.Dr.Azhar Abbas Esmail    member

Asst.prof.Dr.Rassa Zuhair Jasim      member

Asst.prof.Dr.Noorhan Khalid Shafeeq      supervisor member

Abstract    

The study aimed to partial purify of Leucine aminopeptidase (LAP) from sera of patients with hyperthyroidism and hypothyroidism.In this study, specimens were collected during the period from 1st Nov 2017 until the end of Feb 2018 at Endocrine and Diabetes Center / Baghdad.  Samples of blood were collected from fifty healthy control and two hundred patients, patients divided into four groups consisted of (50) with hyperthyroidism, (50) with hypothyroidism, (50) with sub clinical hyperthyroidism and (50) with sub clinical hypothyroidism. The aged for all subjects ranged between (15-60) years with body mass index ranged (25- 31) kg/m2.

     The study was included partial purified of LAP from sera of (hyperthyroidism and hypothyroidism) patients with some techniques which included precipitation with ammonium sulfide (35% – 75%),ion exchange chromatography using DEAE- Sepharose column that detected four protein peaks only two peaks have LAP activity, the fractions containing LAP activity from each peak was applied to sepharose 6B column and only one protein peak that have LAP activity was obtained from each peak, with purification fold (14.13 , 19.88), yield (29.72, 31.25) for hyperthyroidism and hypothyroidism respectively.

      The SDS-polyacrylamide gel electrophoresis presented only one protein band for each peak with a molecular weight (~ 130KD, ~ 63KD) of LAP that purified from sera of hyperthyroidism and (~ 125KD, ~ 61KD) with the single band to LAP which it purified from sera of hypothyroidism, these peaks could be dimer and monomer of LAP.

Also, the study was included evaluation of some biochemical parameters in the sera of (sub clinical hyperthyroidism, hyperthyroidism, sub clinical hypothyroidism, hypothyroidism) patients which included estimation the level of (TSH, FT3, FT4, LAP) and some antioxidants (Malondialdehyde, Peroxynitrite) and compared with the healthy control

The results of Sub clinical hyperthyroidism patients were showed a highly significant increase (p≤0.001) in the level of LAP, peroxynitrite and MDA levels in the patient´s group compared with the control group, while a highly significant decrease in TSH levels was found in the patient group compared with the control group.

There was a highly significant elevation(p≤0.001)in each of FT3, FT4,LAP,peroxynitrite and MDA levels in the hyperthyroidism patients  compared with the control group, while a significant decrease(p≤0.05) was noticed in BMI and a highly significant decrease(p≤0.001) in TSH levels, in the patient´s group compared with the control group, also the results of sub clinical hypothyroidism patients showed a highly significant elevation (p≤0.001) in TSH, LAP, peroxynitrite and MDA levels in the patient´s group compared with the control group

 In hypothyroidism patients result showed a highly significant decrease (p≤0.001) in FT3,FT4 levels in the patient group compared to the control group, while a significant elevation in BMI and a highly significant elevation (p≤0.001) in TSH, LAP, peroxynitritr and MDA levels was found in the patient group compared with the control group.

The correlation coefficient (r) between the LAP level and other parameters calculated with regression plot showed in sub clinical hyperthyroidism group asignificant positive correlation between LAP with (FT3, FT4) in the control and a negative correlation in patient group, also, the results showed negative correlation of LAP with TSH in the control and patients groups.

 In hyperthyroidism was a significant positive correlation of LAP with FT3 in the control group and patients group with a significant positive correlation of LAP with FT4 in the control group but negative correlation in the patient group, also, results showed a significant negative correlation of LAP with TSH in the control group and positive correlation inpatient group

In sub clinical hypothyroidism was a significant positive correlation of LAP with FT3,FT4 in the control and patient groups and a significant negative correlation of LAP with TSH in the control and patient groups, but in hypothyroidism results showed a significant positive correlation of LAP with FT3in the control group and a significant negative correlation in the patients group, also,there was a significant positive correlation of LAP with FT4 in the control and patient groups as well,a significant negative correlation of LAP with TSH in the control group and a significant positive correlation in the  patient group was showed.

This is the first study of aminopeptidase (LAP) purification from thyroid patients. It is possible that the enzyme has been purified in both dimer and monomer form. Some biochemical parameters such as LAP, pyroxenitrite, and MDA has been associated with thyroid hormone in the patient group suggest that these parameters have an effect these diseases